Composiciones para aumentar la estabilidad y actividad de polipéptidos, y métodos relacionados.

Un método para aumentar la estabilidad de un polipéptido, que comprende unir dicho polipéptido a una marca peptídica que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 % idéntica a la SEC ID Nº 1

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Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IB2010/003127.

Solicitante: Solis BioDyne OÜ.

Nacionalidad solicitante: Estonia.

Dirección: Riia 185a 51014 Tartu ESTONIA.

Inventor/es: KAHRE,OLEV, ARTMA,KADRI, KAHRE,TIINA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > C07K14/00 (Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > C12N9/00 (Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas)

PDF original: ES-2533536_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Composiciones para aumentar la estabilidad y actividad de polipéptidos, y métodos relacionados Antecedentes de la invención

Existe la necesidad en la técnica de métodos y composiciones que potencien la estabilidad de proteínas. Existe particularmente la necesidad de composiciones que potencien la estabilidad de polimerasas tales como polimerasas Taq de modo que puedan retener la actividad enzimática después de exposición a corto plazo o largo plazo a temperaturas por encima de congelación. Existe también la necesidad en la técnica de composiciones que potencien la fidelidad, sensibilidad, y rendimiento de las polimerasas. Se describen proteínas de fusión estabilizadas que tienen la cola ácida de sinucleína en Lee et al. Pharmaceutical Research 22, 1 (25) 1735-1746.

Sumario de la invención

La invención es como se define en las reivindicaciones.

Esta descripción proporciona péptidos, polipéptidos, polipéptidos de fusión, composiciones, y métodos para posibilitar la retención de la actividad de una enzima (por ejemplo, ADN polimerasa, ARN polimerasa, nucleasa, transcriptasa inversa, ADN desaminasa, ARN desaminasa, proteasa) o una proteína (por ejemplo, eritropoyetina, factor inhibidor de leucemia humana (hLIF), factor estimulador de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF), insulina, factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), leptina, bevacizumab) después de exposición a corto plazo o largo plazo a una temperatura de aproximadamente -2 2C a aproximadamente 35 2C. Los péptidos, polipéptidos, polipéptidos de fusión, o composiciones proporcionados en este documento pueden potenciar la estabilidad de una enzima o proteína a temperatura ambiente. Una enzima o proteína proporcionada en este documento puede ser cualquier proteína de unión a ácido nucleico, por ejemplo, una proteína de unión a ADN, una proteína de unión a ARN, un fragmento de las mismas, o cualquier combinación de las mismas. Una enzima o proteína proporcionada en este documento puede unirse a otras proteínas, por ejemplo, receptores de hormonas.

En algunas realizaciones, los polipéptidos, polipéptidos de fusión, o composiciones proporcionados en este documento retienen la actividad a una temperatura entre -2 2C y 5 2C. En algunas realizaciones, los polipéptidos, polipéptidos de fusión, o composiciones retienen la actividad enzimática o actividad hormonal a una temperatura entre -2 2C y 5 2C. En algunas realizaciones, la actividad enzimática o actividad hormonal de los polipéptidos, polipéptidos de fusión, o composiciones después de su exposición a una temperatura entre -2 2C y 5 2C es al menos el 5 % de la actividad enzimática del polipéptido antes de su exposición a dicha temperatura.

Las marcas peptídicas proporcionadas en este documento aumentan la estabilidad de los polipéptidos. En algunas realizaciones, las marcas peptídicas inhiben la pérdida de actividad enzimática de los polipéptidos. En algunas realizaciones, las marcas peptídicas inhiben la degradación de los polipéptidos, polipéptidos de fusión, o composiciones. En algunas realizaciones, las marcas peptídicas aumentan la estabilidad o inhiben la pérdida de actividad enzimática de los polipéptidos durante al menos un día. En algunas realizaciones, las marcas peptídicas aumentan la estabilidad o inhiben la pérdida de actividad enzimática de los polipéptidos durante al menos una semana. En algunas realizaciones, las marcas peptídicas aumentan la estabilidad o inhiben la pérdida de actividad enzimática de los polipéptidos durante al menos un mes.

En algunas realizaciones, los polipéptidos proporcionados en este documento muestran estabilidad, actividad enzimática, o actividad hormonal potenciada en comparación con un polipéptido similar que no comprende una marca peptídica proporcionada en este documento. En algunas realizaciones, los polipéptidos tienen al menos un 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, o 95 % de la actividad enzimática o actividad hormonal de un polipéptido similar que no comprende a marca peptídica proporcionada en este documento. En algunas realizaciones, los polipéptidos tienen al menos un 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, o 95 % de la actividad enzimática o actividad hormonal de un polipéptido similar que no comprende una marca peptídica proporcionada en este documento, después de su exposición a una temperatura entre -2 2C y 5 2C. En algunas realizaciones, los polipéptidos tienen al menos un 5 %, 1 %, 15 %, 2 %, 25 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 1 %, o 2 % mayor actividad enzimática o actividad hormonal que la actividad enzimática o actividad hormonal de un polipéptido similar que no comprende una marca peptídica proporcionada en este documento, después de su exposición a una temperatura entre -2 2C y 5 2C.

Los polipéptidos se unen a una marca peptídica que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 7 % idéntica a la SEC ID N2 1. En algunas realizaciones, la marca peptídica tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N2 1, SEC ID N2 13, o SEC ID N2 14. También se proporcionan en este documento marcas peptídicas que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 7 % idéntica a la SEC ID N213 o SEC ID N2 14. En algunas realizaciones, los polipéptidos, unidos a marcas peptídicas proporcionadas en este documento, comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos un 7 % idéntica a la SEC ID N2 6, SEC ID N2 8, o SEC ID N2 11. En algunas realizaciones, los polipéptidos, unidos a marcas peptídicas proporcionadas en este documento, comprenden una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N2 6, SEC ID N2 8, o SEC ID N211. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 7 %

idéntica a la SEC ID N2 1, SEC ID N2 6, SEC ID N2 8, SEC ID N2 11, SEC ID N2 13, SEC ID N2 14, SEC ID N2 16, SEC ID N2 18, SEC ID N2 2, SEC ID N2 22. En algunas realizaciones, los polipéptidos no tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N2 2, SEC ID N2 6, o SEC ID N211.

En algunas realizaciones, los polipéptidos proporcionados en este documento se unen a una marca peptídica que está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos un 7 % idéntica a la SEC ID N2 3 o SEC ID N2 15. En algunas realizaciones, los polipéptidos proporcionados en este documento se unen a una marca peptídica que está codificada por una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID N2 3 o SEC ID N2 15. También se proporciona en este documento un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos un 7 % idéntica a la SEC ID N2 4, SEC ID N2 5, SEC ID N2 7, o SEC ID N2 12. También se proporciona en este documento un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID N2 4, SEC ID N2 5, SEC ID N2 7, o SEC ID N2 12.

También se proporciona en este documento un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 7 % idéntica a la SEC ID N21. También se proporciona en este documento un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N2 1. También se proporciona en este documento un polipéptido que comprenden un motivo de secuencia que se une a un ADN bicatenario. También se proporciona en este documento un polipéptido que está codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos un 7 % idéntica a la SEC ID N2 9. También se proporciona en este documento un polipéptido que está codificado por una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID N2 9. También se proporciona en este documento un polipéptido codificado por la SEC ID N2 3, SEC ID N2 5, SEC ID N2 7, SEC ID N2 12, SEC ID N2 15, SEC ID N2 17, SEC ID N2 19, SEC ID N2 21, o SEC ID N2 23.

Se describen en este documento polipéptidos de fusión que comprenden... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para aumentar la estabilidad de un polipéptido, que comprende unir dicho polipéptido a una marca peptídica que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 7 % idéntica a la SEC ID N21.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la marca peptídica tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N2 1, SEC ID N2 13, SEC ID N2 14, SEC ID N2 16, o SEC ID N2 18; o la marca peptídica está codificada por una secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID N2 3, SEC ID N215, SEC ID N217, o SEC ID N219.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la marca peptídica comprende al menos uno a seis restos de histidina.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la marca peptídica comprende un sitio de escisión por proteasa, opcionalmente en el que el sitio de escisión por proteasa comprende la secuencia de aminoácidos DDDDK.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la marca peptídica inhibe la degradación o la desnaturalización o la pérdida de la función proteica del polipéptido a una temperatura de entre -2 2C y 5 2C, opcionalmente en el que la función proteica del polipéptido después de exposición a dicha temperatura es al menos el 5 % de la función proteica del polipéptido antes de su exposición a dicha temperatura.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la marca peptídica mantiene la estabilidad del polipéptido durante al menos un día en una temperatura de entre -2 2C y 5 2C.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la marca peptídica se une covalentemente o no covalentemente al polipéptido.

8. El método de la reivindicación 1, en el que la marca peptídica se une al extremo amino o al extremo carboxi del polipéptido.

9. El método de la reivindicación 1, en el que el polipéptido es eritropoyetina, factor inhibidor de leucemia humana (hLIF), factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), insulina, factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), leptina o bevacizumab, opcionalmente en el que el polipéptido comprende al menos una mutación.

1. El método de la reivindicación 1, en el que el polipéptido unido a la marca peptídica tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N2 6, SEC ID N2 8, SEC ID N2 11, SEC ID N2 2, o SEC ID N2 22; o el polipéptido unido a la marca peptídica está codificado por una secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID N2 5, SEC ID N2 7, SEC ID N212, SEC ID N2 21, o SEC ID N2 23.

11. El método de la reivindicación 1, en el que el polipéptido es una proteína o una enzima termoestables, opcionalmente en el que:

(i) dicha proteína termoestable es un péptido o un polipéptido cosméticos; o

(ii) dicha enzima es una polimerasa, transcriptasa inversa, nucleasa, pirofosfatasa, desaminasa o proteasa, opcionalmente en el que:

(1) la polimerasa es una ADN polimerasa I, ADN polimerasa I de Thermus aquaticus (Taq), ADN polimerasa de Thermococcus gorgonarius (Tgo), ADN polimerasa de Thermus thermophilics (Tth), o ADN polimerasa Z5, o

(2) la pirofosfatasa es una pirofosfatasa de Thermoplasma acidophilum (TAPP), o

(3) la desaminasa es una dCTP desaminasa de Pirococcus horikoshii.

12. El método de la reivindicación 11, en el que la enzima es una polimerasa útil en amplificación de ácidos nucleicos.

13. El método de la reivindicación 12, en el que la polimerasa muestra una actividad enzimática después de su exposición a una temperatura de entre -2 2C y 5 2C.

14. El método de la reivindicación 12, que comprende adicionalmente una segunda polimerasa, opcionalmente en el que dicha segunda polimerasa se une a una secuencia peptídica que es al menos un 7 % homologa a la SEC ID N2 1, SEC ID N2 8, SEC ID N213, SEC ID N214, SEC ID N216, o SEC ID N218.

15. El método de la reivindicación 12, en el que la polimerasa muestra una actividad enzimática después de su exposición a una temperatura de entre 2 2C y 3 2C durante al menos un día, opcionalmente en el que la actividad enzimática es al menos el 5 % de la actividad enzimática de la polimerasa antes de su exposición a dicha temperatura durante al menos un día.