ARN mensajero optimizado.

Un ácido nucleico sintético que codifica alfa-galactosidasa y que difiere en la secuencia de un ácido nucleico dealfa-galactosidasa de tipo salvaje en la medida en que al menos un codón no común o un codón menos comúnha sido reemplazado por un codón común, y donde la secuencia de ácido nucleico sintético presenta al menosuna o más de las siguientes propiedades:

(a) presenta una longitud continua de al menos 90 codones, todos ellos codones comunes

(b) presenta una longitud continua de codones comunes que comprenden al menos el 60% de loscodones de la secuencia de ácidos nucleicos sintéticos;

(c) al menos el 94% o más de los codones en la secuencia de ácido nucleico sintético que codifica laproteína son codones comunes y la secuencia de ácido nucleico sintético codifica una proteína deal menos aproximadamente 90 aminoácidos de longitud;

(d) presenta una longitud de al menos 80 pares de base,

en el que por codón común se entiende Ala (gcc), Arg (cgc), Asn (aac), Asp (gac), Cys (tgc), Gln (cag), Gly(ggc), His (cac), Ile (atc), Leu (ctg), Lys (aag), Pro (ccc), Phe (ttc), Ser (agc), Thr (acc), Tyr (tac), Glu (gag) y Val(gtg);

en el que los codones menos comunes son: Gly (ggg), Ile (att), Leu (ctc), Ser (tcc), Val (gtc) y Arg (agg); y

en el que todos los codones que no se consideren comunes o menos comunes son codones no comunes.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2001/042655.

Solicitante: Shire Human Genetic Therapies, Inc.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 300 Shire Way Lexington MA 02421 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: MILLER, ALLAN, M., SELDON,RICHARD F, TRECO,DOUGLAS S.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS;... > C07H21/00 (Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K48/00 (Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/63 (Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/745 (Factores de coagulación sanguínea o de fibrinolisis)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/67 (Métodos generales para favorecer la expresión)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/40 (actúan sobre los enlaces alfa-galactosa-glicósido, p. ej. alfa-galactosidasa)

PDF original: ES-2437815_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

ARN mensajero optimizado Campo de la invención [0001] La invención se refiere a métodos para optimizar las propiedades de moléculas de ARNm, moléculas de ARNm optimizado, métodos de utilización de moléculas de ARNm optimizado y composiciones que incluyen moléculas de ARNm optimizado.

Antecedentes de la invención [0002] En eucaroytes, la expresión génica se ve afectada, en parte, por la estabilidad y estructura de la molécula de ARN mensajero (ARNm) . La estabilidad del ARNm influye en la expresión génica al afectar el nivel en estado estacionario del ARNm. Puede afectar las tasas a las que desaparece el ARNm tras la represión de la transcripción y se acumula después de la inducción de la transcripción. La estructura y la secuencia de nucleótidos de la molécula de ARNm también pueden influir en la eficacia con la que se traducen estas moléculas individuales de ARNm.

La estabilidad intrínseca de una molécula de ARNm determinada está influida por una serie de elementos específicos de la secuencia interna que pueden ejercer un efecto de desestabilización en el ARNm, Estos elementos pueden estar situados en cualquier región de la transcripción y, por ejemplo, se pueden encontrar en la región 5’ no traducida (5’UTR) , en la región de codificación y en la región 3’ no traducida (3’ UTR) . Está probado que el acortamiento del extremo de poli (a) inicia la descomposición del ARNm (Ross, Trends in Genetics, 12:717-175, 1996) . La cola de poli (A) influye en la estabilidad del ARNm citoplasmático protegiendo el ARNm de la degradación rápida. Los elementos ricos en adenosina y uridina (AURE) en la 3’UTR también se asocian con ARNm de mamífero inestable. Se ha demostrado que las proteínas que se unen a los AURE, proteínas de unión a AURE (AUPB) pueden afectar a la estabilidad del ARNm. La región de codificación también puede alterar la vida media de muchos ARN. Por ejemplo, la región de codificación puede interaccionar con las proteínas que la protegen del ataque endonucleolítico. Además, la eficacia con la que las moléculas de ARNm individuales se traducen tiene una fuerte influencia en la estabilidad de la molécula de ARNm (Herrick et al., Mol Cell Biol. 10, 2269-2284, 1990, y Hoekema et al., Mol Cell Biol. 7, 2914-2924, 1987) .

La naturaleza de cadena sencilla del ARNm le permite adoptar la estructura secundaria y terciaria de un modo dependiente de la secuencia a través del apareamiento de bases complementario. Entre los ejemplos de estas estructuras se incluyen: horquillas de ARN, estructuras tallo-lazo y estructuras más complejas como las bifurcaciones, pseudonudos y triples hélices. Estas estructuras influyen en la estabilidad del ARNm, p.ej., los elementos de la horquilla en la 3’UTR pueden servir como un sitio de escisión de endonucleasa, y afectan a la eficiencia de la traducción.

Además de la estructura del ARNm, el contenido de nucleótidos del ARNm también puede desempeñar un papel en la eficacia con la que se traduce el ARNm. Por ejemplo, el ARNm con un alto contenido de GC en la región 5’ no traducida (5’UTR) puede traducirse con poca eficacia y un efecto de traducción reducido puede disminuir la estabilidad del mensaje. Por tanto, la alteración de la secuencia de una molécula de ARNm puede, en última instancia, influir en la estabilidad del transcrito del ARNm, por la influencia en la estabilidad de la traducción del mensaje.

Factor VIII y Factor IX son proteínas plasmáticas importantes que participan en la vía intrínseca de la coagulación sanguínea. Su disfunción o ausencia en los sujetos puede provocar trastornos en la coagulación sanguínea, p.ej, déficit de Factor VIII o Factor IX da lugar a hemofilia A o B, respectivamente. El aislamiento del Factor VIII o Factor IX de la sangre es difícil, p.ej., el aislamiento del Factor VIII se caracteriza por bajo rendimiento y también tiene el peligro asociado de contaminarse con agentes infecciosos como el virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C

o VIH. La tecnología de ADN recombinante proporciona un método alternativo para producir Factor VIII o Factor IX biológicamente activos. Aunque estos métodos han cosechado éxito, continúa siendo un desafío mejorar el rendimiento de Factor VIII o Factor IX.

Un enfoque para aumentar la producción de proteína utilizando la tecnología de ADN recombinante es modificar la secuencia de codificación de una proteína de interés, p.ej., Factor VIII o Factor IX, sin alterar la secuencia de aminoácidos del producto génico. Este enfoque implica la alteración de, por ejemplo, la secuencia del gen del Factor VIII

o Factor IX nativos, de modo que los codones que no se utilizan tan frecuentemente en células de mamíferos se sustituyen con codones que están sobreexpresados en genes de mamíferos altamente expresados. Seed et al., (WO 98/12207) utilizaron este enfoque con cierto éxito. Descubrieron que la sustitución de codones de mamíferos escasos con los que se utilizan con frecuencia en las células de mamíferos conlleva un aumento de cuatro veces en la producción del Factor VIII a partir de células de mamíferos.

D1 (WO98/11206) muestra que un sujeto del que se sospecha que tiene déficit de a-gal A como la enfermedad de Fabr y puede tratarse con (1) células humanas que se han modificado genéticamente para sobreexpresar y secretar

a-gal A humana o (2) a-gal A humana purificada obtenida a partir de células humanas genéticamente modificadas y cultivadas.

Resumen de la invención [0009] La invención proporciona un ácido nucleico sintético de acuerdo con la reivindicación 1. Se describen otras características de la invención en las reivindicaciones dependientes. También se proporciona un vector de acuerdo con la reivindicación 5. Además, se proporciona una célula que contiene el vector según la reivindicación 6. La invención también proporciona un método de producción de alfa-galactosidasa de acuerdo con la reivindicación 7. También se presenta el uso de un ácido nucleico sintético que dirige la síntesis de un mensaje optimizado para la alfa-galactosidasa en la preparación de un medicamento según la reivindicación 10. Además, se muestra un ácido nucleico sintético que dirige la síntesis de un mensaje optimizado para alfa-galactosidasa en la preparación de un medicamento según la reivindicación 11. Otras características de las reivindicaciones 10 y 11 se definen en las reivindicaciones dependientes 12 a 16.

El ácido nucleico sintético puede dirigir la síntesis de un ARNm mensajero optimizado. En un modo de realización preferente, la extensión continua de los codones comunes puede incluir: la secuencia de una pre-proproteína; la secuencia de una pro-proteína; la secuencia de una proteína madura; la “pre” secuencia de una pre-proproteína; la secuencia “pre-pro” de una pre-pro-proteína; la secuencia “pro” de una pre-pro o una pro-proteína; o una parte de cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas.

En un modo de realización preferido, la secuencia de ácido nucleico sintético incluye una longitud continua de al menos 90, 95, 100, 125, 150, 200, 250, 300 o más codones, todos ellos codones comunes.

En otro modo de realización preferente, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína tiene al menos 30, 50, 60, 75, 100, 200 o más codones no comunes o menos comunes sustituidos con un codón común.

En un modo de realización preferido, el número de codones no comunes o menos comunes reemplazado es inferior a 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1.

En un modo de realización preferido, el número de codones no comunes o menos comunes que quedan... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un ácido nucleico sintético que codifica alfa-galactosidasa y que difiere en la secuencia de un ácido nucleico de alfa-galactosidasa de tipo salvaje en la medida en que al menos un codón no común o un codón menos común ha sido reemplazado por un codón común, y donde la secuencia de ácido nucleico sintético presenta al menos una o más de las siguientes propiedades:

(a) presenta una longitud continua de al menos 90 codones, todos ellos codones comunes

(b) presenta una longitud continua de codones comunes que comprenden al menos el 60% de los codones de la secuencia de ácidos nucleicos sintéticos;

(c) al menos el 94% o más de los codones en la secuencia de ácido nucleico sintético que codifica la

proteína son codones comunes y la secuencia de ácido nucleico sintético codifica una proteína de al menos aproximadamente 90 aminoácidos de longitud;

(d) presenta una longitud de al menos 80 pares de base, en el que por codón común se entiende Ala (gcc) , Arg (cgc) , Asn (aac) , Asp (gac) , Cys (tgc) , Gln (cag) , Gly (ggc) , His (cac) , Ile (atc) , Leu (ctg) , Lys (aag) , Pro (ccc) , Phe (ttc) , Ser (agc) , Thr (acc) , Tyr (tac) , Glu (gag) y Val

(gtg) ; en el que los codones menos comunes son: Gly (ggg) , Ile (att) , Leu (ctc) , Ser (tcc) , Val (gtc) y Arg (agg) ; y en el que todos los codones que no se consideren comunes o menos comunes son codones no comunes.

2. El ácido nucleico sintético de la reivindicación 1 en el que se inserta el ácido nucleico de la alfa-galactosidasa en una célula no transformada.

3. El acido nucleico sintético de la reivindicación 1, en el que el número de codones no comunes o menos comunes restantes es menor de 15.

4. El ácido nucleico sintético de la reivindicación 1, en el que los codones no comunes o menos comunes se reemplazan por codones comunes.

5. Un vector que comprende el ácido nucleico sintético de la reivindicación 1, 3 o 4.

6. Una célula que comprende el vector de la reivindicación 5.

7. Un método para producir alfa-galactosidasa que comprende el cultivo de la célula de la reivindicación 6 en condiciones en las que se expresa el ácido nucleico.

8. Un método para preparar un ácido nucleico que codifica alfa-galactosidasa cuya longitud alcanza al menos 90 codones, que comprende:

(a) identificar un codón no común y un codón menos común en una secuencia de genes no optimizada que codifica una proteína de alfa-galactosidasa; y

(b) reemplazar al menos el 94% de los codones no comunes y menos comunes por un codón común que codifica el mismo aminoácido que el codón sustituido;

en el que por codón común se entiende Ala (gcc) , Arg (cgc) , Asn (aac) , Asp (gac) , Cys (tgc) , Gln (cag) , Gly 35 (ggc) , His (cac) , Ile (atc) , Leu (ctg) , Lys (aag) , Pro (ccc) , Phe (ttc) , Ser (agc) , Thr (acc) , Tyr (tac) , Glu (gag) y Val (gtg) ;

en el que los codones menos comunes son Gly (ggg) , Ile (att) , Leu (ctc) , Ser (tcc) , Val (gtc) y Arg (agg) ; y

en el que todos los codones que no se consideren codones comunes ni codones menos comunes son codones no comunes.

9. El método de la reivindicación 8, en el que al menos el 96% de los codones no comunes y menos comunes son reemplazados por un codón común que codifica el mismo aminoácido que el codón sustituido.

10. El uso de un ácido nucleico sintético de la reivindicación 1 que permite la síntesis de un mensaje optimizado para alfa-galactosidasa en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad

caracterizada por déficit de la alfa-galactosidasa en un sujeto, en el que se introduce el ácido nucleico sintético en el sujeto y el sujeto expresa la alfa-galactosidasa.

11. Un ácido nucleico sintético de la reivindicación 1 que permite la síntesis de un mensaje optimizado para alfagalactosidasa para su uso en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por déficit de la alfa

galactosidasa en un sujeto, en el que se introduce el ácido nucleico sintético en el sujeto y el sujeto expresa la alfa-galactosidasa.

12. El uso de la reivindicación 10 o del ácido nucleico sintético de la reivindicación 11, en el que se introduce el ácido nucleico sintético en una célula.

13. El uso de la reivindicación 10 o del ácido nucleico sintético de la reivindicación 11, en el que la célula puede ser 10 una célula xenogénica, alogénica o autóloga.

14. El uso de la reivindicación 10 o del ácido nucleico sintético de la reivindicación 11, en el que al menos el 98% o el conjunto de todos los codones de la secuencia de ácido nucleico sintético son codones comunes.

15. El uso de la reivindicación 10 o del ácido nucleico sintético de la reivindicación 11, en el que el sujeto padece la enfermedad de Fabr y .

16. El ácido nucleico sintético de la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico sintético comprende la SEQ ID Nº:

106.

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