ARN de interferencia para el tratamiento de trastornos relacionados con la ganancia de función.

Una cantidad efectiva de un agente de ARNi seleccionado de agentes de ARNpi y ARNph para uso en el tratamiento de la enfermedad de Huntington causada por una mutación en el gen htt que codifica una proteína Huntingtina mutante de ganancia de función,

dirigiendo un solo polimorfismo de nucleótido que no causa enfermedad localizado en un sitio distinto de una mutación que causa enfermedad dentro del gen htt que codifica la proteína Huntingtina mutante, de tal manera que se presenta la interferencia específica de dicho gen, en donde el agente de ARNi se dirige a una región polimórfica en el gen que es distinta de una región expandida de CAG dentro del gen mutante.

ARN de interferencia para el tratamiento de trastornos relacionados con la ganancia de función Antecedentes de la invención ARN de interferencia (ARNi) es el mecanismo de silenciamiento génico post-transcripcional específico de una secuencia, iniciado por los ARN bicatenarios (ARNbc) homólogos al gen que se suprime. Los ARNbc son procesados por Dicer, una ribonucleasa celular III, para generar dúplex de aproximadamente 21 nt con salientes 3' (ARN pequeño de interferencia, ARNpi) que median la degradación del ARNm específico de una secuencia. En células de mamíferos, las moléculas de ARNpi son capaces de silenciar específicamente la expresión génica sin inducción de la vía de respuesta inespecífica de interferón. Por lo tanto, los ARNpi se han convertido en una nueva y poderosa alternativa para otras herramientas genéticas tales como oligonucleótidos antisentido y ribozimas para analizar la función de los genes. Además, los ARNpi se están desarrollando con fines terapéuticos, con el fin de silenciar los genes causantes de enfermedades en los seres humanos.

Las enfermedades de repetición de trinucleótidos comprenden un grupo recientemente reconocido de trastornos hereditarios. La mutación genética común es un aumento en una serie de una repetición de trinucleótidos en particular. Hasta la fecha, la repetición de trinucleótidos más frecuente es CAG, que codifica para el aminoácido glutamina. Se conocen al menos 9 enfermedades de repetición de CAG y existen más de 20 variedades de estas enfermedades, incluyendo la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Kennedy y muchas enfermedades espinocerebelosas. Estos trastornos comparten un componente neurodegenerativo en el cerebro y / o la médula espinal. Cada enfermedad tiene un patrón específico de neurodegeneración en el cerebro y la mayoría tiene una herencia autosómica dominante.

El inicio de las enfermedades en general se produce alrededor de los 30 a 40 años de edad, pero en la enfermedad de Huntington repeticiones de CAG en el gen de la Huntingtina de > 60 presagiar un inicio juvenil.

La investigación reciente por parte de los presentes inventores ha demostrado que la mutación genética (aumento de la longitud de repeticiones de CAG desde normal <36 en el gen de la Huntingtina hasta > 36 en el caso de la enfermedad) se asocia con la síntesis de una proteína Huntingtina mutante, que tiene > 36 poliglutaminas (Aronin et al., 1995) . También se ha demostrado que la proteína forma agregados citoplasmáticos e inclusiones nucleares (Difiglia et al., 1997) y se asocia con vesículas (Aronin et al., 1999) . Las vías patógenas precisas no se conocen.

Se cree que la enfermedad de Huntington (y por implicación otras enfermedades de repetición de trinucleótidos) es causada, al menos en parte, por interacciones aberrantes de proteínas, que causan deterioro de procesos neuronales críticos, disfunción neuronal y en última instancia la muerte neuronal (neurodegeneración en áreas del cerebro llamadas el cuerpo estriado y corteza) . En la búsqueda de un tratamiento efectivo para estas enfermedades, los investigadores en este campo destacaron la comprensión de la patogénesis de la enfermedad y en un principio trataron de interceder al nivel de las presuntas interacciones de proteínas aberrantes. Sin embargo, no existe un tratamiento efectivo para la enfermedad de Huntington o de otras enfermedades causadas por repetición de trinucleótidos. Además, hoy en día se observa que múltiples procesos anormales pueden ser activos en estos tipos de enfermedad.

Resumen de la invención La presente invención se define en y por medio de las reivindicaciones anexas.

Se han propuesto otros métodos basados en ARNi para la destrucción de genes mutantes en los que los ARNpi están dirigidos, por ejemplo, a una mutación puntual que se presenta en un solo alelo en el gen mutante (por ejemplo, la mutación puntual en el gen para la superóxido dismutasa (SOD) asociada con la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) ) . Sin embargo, hay una diferencia clave entre la ELA y las enfermedades de repetición de trinucleótidos, tales como la enfermedad de Huntington. ELA tiene una mutación puntual en un alelo como el cambio genético, mientras que las enfermedades de repetición de trinucleótidos tienen una región de repetición de CAG expandida en un alelo como el cambio genético. El uso de ARNi contra la región de repetición expandida de CAG tiene complicaciones potenciales. Se sabe que existen más de 80 genes normales con regiones de repetición de CAG en las células. Por lo tanto, los ARNpi dirigidos a estas repeticiones de CAG no se pueden utilizar sin correr el riesgo de la destrucción generalizada de los ARNm que contiene la repetición de CAG normal. Del mismo modo, el enfoque en sitios no específicos de alelo daría lugar a la pérdida tanto de Huntingtina normal como mutante lo que provoca disfunción neuronal.

La invención utilizan la tecnología de ARN de interferencia (ARNi) contra regiones polimórficas seleccionadas (es decir, regiones que contienen polimorfismos específicos alélicos o específicos del alelo) que son distintos del sitio de mutación en los genes que codifican proteínas mutantes. La presente invención proporciona tratamientos efectivos para enfermedades por ganancia de función resultantes de mutaciones por supresión, mutaciones por inserción, mutaciones puntuales, y similares, siempre que el gen mutante codifique una proteína que tenga una función que

normalmente no esté asociada con una proteína de tipo silvestre.

La presente invención proporciona un tratamiento efectivo para la enfermedad de Huntington (HD) . La invención también puede proporcionar tratamientos efectivos para otros trastornos por poliglutamina y / o una enfermedad por repetición de trinucleótidos, como se describe en detalle en la presente invención.

En una realización, la proteína mutante contiene una región de poliglutamina expandida. En otra realización, el gen que codifica la proteína mutante contiene una región de repetición de trinucleótidos expandida.

La invención puede utilizar agentes de ARNi homólogos a un polimorfismo alélico en el gen que codifica, por ejemplo, una proteína Huntingtina mutante para el tratamiento de la enfermedad de Huntington. En una forma de realización preferida, el agente de ARNi puede dirigir un polimorfismo alélico seleccionado del grupo que consiste de P1-P5. En una forma de realización preferida adicional, el agente de ARNi puede dirigir un polimorfismo alélico seleccionado del grupo que consiste de P6-P43.

En una realización adicional, la invención proporciona agentes de ARNi que constan de una primera y una segunda cadena que contienen cada una 16 -25 nucleótidos. La primera cadena de la presente invención puede ser homóloga a una región de un gen que codifica una proteína mutante de ganancia de función, en la que la secuencia de nucleótidos de la proteína mutante de ganancia de función comprende un polimorfismo alélico. La segunda cadena incluye 16 -25 nucleótidos complementarios a la primera cadena. El agente de ARNi también puede tener una porción de bucle que comprende 4 -11, por ejemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, nucleótidos que conecta las dos secuencias de nucleótidos. La región objetivo de la secuencia de ARNm se puede localizar en una región 5' no traducida (UTR) o una UTR 3' del ARNm de una proteína mutante.

La invención proporcionar un constructo de expresión que comprende un ácido nucleico aislado que codifica una molécula de ácido nucleico con una primera secuencia de 16 -25 nucleótidos homólogos a un polimorfismo alélico dentro de, por ejemplo, el gen que codifica una proteína Huntingtina mutante. El constructo de expresión puede ser, por ejemplo, un vector viral, un vector retroviral, un casete de expresión o un plásmido. El constructo de expresión puede tener también una secuencia del promotor de la ARN polimerasa II o una secuencia del promotor de la ARN Polimerasa II, tal como, el promotor de ARNpn U6 del promotor H1.

En aún otras formas de realización, la presente invención proporciona células huésped (por ejemplo, células de mamífero) que comprenden moléculas de ácido nucleico y constructos de expresión de la presente invención.

En incluso otras formas de realización, la presente invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Figuras... [Seguir leyendo]

1. Una cantidad efectiva de un agente de ARNi seleccionado de agentes de ARNpi y ARNph para uso en el tratamiento de la enfermedad de Huntington causada por una mutación en el gen htt que codifica una proteína Huntingtina mutante de ganancia de función, dirigiendo un solo polimorfismo de nucleótido que no causa enfermedad localizado en un sitio distinto de una mutación que causa enfermedad dentro del gen htt que codifica la proteína Huntingtina mutante, de tal manera que se presenta la interferencia específica de dicho gen, en donde el agente de ARNi se dirige a una región polimórfica en el gen que es distinta de una región expandida de CAG dentro del gen mutante.

2. El agente de ARNi de la reivindicación 1 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho gen comprende una región expandida de repetición de trinucleótidos.

3. El agente de ARNi de la reivindicación 1 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha proteína mutante comprende un dominio expandido de poliglutamina.

4. El agente de ARNi de la reivindicación 1 para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el agente de ARNi comprende una primera cadena que comprende aproximadamente 16-25 nucleótidos homóloga a una región del gen que comprende el polimorfismo y una segunda cadena que comprende aproximadamente 16-25 nucleótidos complementarios a la primera cadena.

5. El agente de ARNi de la reivindicación 1 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cantidad efectiva es una cantidad efectiva para inhibir la expresión o actividad de la proteína mutante.

6. Un agente de ARNi que comprende una primera cadena que comprende aproximadamente 16-25 nucleótidos homólogos a una región de un gen que codifica una proteína Huntingtina mutante de ganancia de función, comprendiendo dicha región un solo polimorfismo de nucleótido que no causa enfermedad localizado en un sitio distinto de una mutación que causa enfermedad, y una segunda cadena que comprende aproximadamente 16-25 nucleótidos complementarios a la primera cadena, en donde el agente de ARNi dirige la escisión específica objetivo de un ARNm transcrito del gen que codifica la proteína Huntingtina mutante.

7. El agente de ARNi de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho polimorfismo se selecciona ya sea de entre el grupo que comprende PI-P5, o seleccionado de entre el grupo que comprende P6-P43.

8. El agente de ARNi de la reivindicación 6 o 7, en donde la primera cadena comprende una secuencia de nucleótidos idéntica a la secuencia de la región que comprende el polimorfismo.

9. El agente de ARNi de la reivindicación 6, 7 u 8, que comprende además una porción de bucle que comprende 4 11 nucleótidos que conectan las dos cadenas.

10. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el agente de ARNi de cualquiera de las reivindicaciones 6 a

9.

11. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10.

12. El vector de la reivindicación 11, que es un vector viral, vector retroviral, casete de expresión, o plásmido; y en cuyo caso comprende además opcionalmente un promotor de ARN polimerasa III o ARN polimerasa II; y en cuyo caso opcionalmente además en donde el promotor de la ARN polimerasa III es el promotor U6 o HI.

13. Una célula huésped que comprende el agente de ARNi, la molécula de ácido nucleico, o el vector de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12.

14. La célula huésped de la reivindicación 13, que es una célula huésped de mamífero, en cuyo caso opcionalmente, en donde la célula huésped es una célula de mamífero no humano o una célula humana.

15. Una composición que comprende el agente de ARNi, la molécula de ácido nucleico, el vector o la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. Un agente de ARNi seleccionado de ARNpi y ARNph para uso en el tratamiento de la enfermedad de Huntington mediante la identificación de un único polimorfismo de nucleótido en el gen htt que codifica una proteína Huntingtina mutante de ganancia de función y la administración del agente de ARNi que dirige dicho polimorfismo de tal manera que se reduce la proteína mutante, en donde el polimorfismo es un polimorfismo de un solo nucleótido que no causa enfermedad situado en un sitio distinto de una mutación dentro de un región polimórfica que es distinta de una región expandida de CAG dentro del gen mutante.