Árboles transgénicos con mayor cantidad de biomasa y de carbohidratos.

La presente invención describe la generación de árboles transgénicos (chopos) que sobreexpresan un gen de pino que codifica un factor de transcripción del tipo Zn-finger de la familia de factores de transcripción tipo Dof (DNA-one finger). Los árboles obtenidos mediante ingeniería genética se caracterizan por presentar mayor contenido en biomasa, altura superior a los controles y mayor actividad fotosintética que se traduce en un contenido en azúcares superior que los árboles no transformados, así como mayor crecimiento vegetativo y número de hojas.

Árboles transgénicos con mayor cantidad de biomasa y de carbohidratos.

La presente invención tiene su aplicación dentro de la industria dedicada al empleo de árboles para la obtención de biomasa principalmente con dos objetivos: producción de madera, papel y producción de bio-combustibles. El chopo es un árbol de crecimiento rápido que presenta una serie de ventajas logísticas y beneficios económicos en relación a otros cultivos anuales que puedan ser utilizados con propósitos similares como los cereales. Una de esas ventajas es la flexibilidad en cuanto al tiempo de cosecha lo que permite reducir los costes de almacenamiento y las pérdidas por degradación del material asociadas con el almacenamiento de biomasa de cultivos recogidos en cosechas anuales. Otra importante ventaja es que no se trata de un cultivo de interés agroalimentario.

Estado de la técnica

La madera se encuentra tradicionalmente entre los cinco productos comerciales más importantes debido a la elevada demanda de sus productos derivados, tales como el papel, fibras o materiales para la construcción. No obstante, el desarrollo de la Biotecnología supone la aparición de nuevas aplicaciones para dicho material, entre ellos está su uso como biocombustible, que puede ser utilizado como sustituto del petróleo. Es más, uno de los inventos mas prometedores del siglo XXI, es la "madera líquida", un material formado en su mayor parte por lignina, con características muy similares al plástico.

El sector forestal, al igual que el agrícola, está fuertemente influido por los ciclos de la naturaleza. Los árboles tienen un crecimiento lento, por lo que la urgencia en la demanda de otros sectores no permite que el bosque se regenere a la misma tasa a la que se consume, por ello es necesario buscar nuevas formas de obtener productos forestales sin tener que acudir a la explotación de los bosques nativos. Además. Las especies arbóreas tienen un enorme valor ecológico por la biodiversidad que presentan y por el relevante papel que juegan frente al efecto invernadero, al ser sumideros importantes de CO₂. Debido a esto, en los últimos 20 años se está investigando profusamente la biología de los árboles forestales, lo que se refleja en un paulatino avance biotecnológico dirigido a su cultivo a gran escala, como ya sucede con muchas especies vegetales de interés agronómico.

Entre las características de interés para la mejora de árboles se encuentran principalmente: el crecimiento, es decir, la generación de biomasa; la forma del tronco, importante para mantener la homogeneidad en los productos; y la calidad de la madera. La investigación actual esta focalizada en las facetas del metabolismo que nos permitan obtener dichas características, y se centra en el estudio de determinados genes relevantes y las diferentes combinaciones entre éstos que determinen los fenotipos requeridos.

La acumulación de metabolitos de interés por parte de las plantas se produce a través de procesos complejos que incluyen múltiples pasos regulados por enzimas, ramificación de rutas metabólicas y regulación por factores de transcripción con funciones en muchos casos redundantes. Por tanto, la manipulación de factores de transcripción puede ser una estrategia efectiva para controlar los niveles de metabolitos tanto desde el punto de vista tanto cualitativo como cuantitativo (Iwase et al., Manipulation of plant metabolis pathways by transcription factors. Plant Biotechnology 26:29-38, 2009). Un único factor de transcripción frecuentemente regula la expresión coordinada de un grupo de genes de la respectiva ruta metabólica en cuestión.

PpDof5 es un factor de transcripción de pino marítimo (Pinus pinaster) que regula la expresión de los genes de Glutamina Sintetasa tanto en tejidos fotosintéticos como no fotosintéticos aunque su expresión mayoritariamente se localiza en las raíces y el tronco del árbol. Funciona de forma dual en la regulación de los genes de GS de pino: activando a GS1b e inhibiendo a GS1a, de esta manera controla la distribución espacial de las isoformas de GS en pino (Rueda-López et al., Differential regulation of two glutamine synthetase genes by a single Dof transcription factor. Plant Journal 56: 73-85, 2008). Filogenéticamente este factor de transcripción está relacionado con factores Dof ancestrales que se originaron antes de la divergencia entre los ancestros de angiospermas y gimnospermas. PpDof5 podría ser uno de los genes Dof más antiguos de pino lo que sugiere que puede estar implicado en la regulación de funciones antiguas y que son esenciales para el árbol.

Análisis recientes del transcriptoma de plantas han relacionado a los factores Dof con la regulación de la producción de lignina (Rogers et al., Comparison of lignin deposition in three ectopic lignification mutants. New Phytologist 168: 123-140, 2005) y con las interacciones carbono-nitrógeno en plantas (Yanagisawa et al., Metabolic engineering with Dof 1 transcription factor in plants: Improved nitrogen assimilation and growth under low-nitrogen conditions. Proc. Natl. Acad, Sci. 101: 7833-7838, 2004). Todo esto pone de manifiesto la importancia de los factores Dof en el desarrollo de los árboles dada su implicación en la regulación de dos rutas esenciales de las plantas: el metabolismo carbonado y el nitrogenado.

Explicación de la invención

La presente invención describe la generación de chopos transgénicos que expresan el factor Dof5 de pino. Los árboles obtenidos mediante ingeniería genética a nivel fenotípico presentan: mayor altura, diámetro del tronco y volumen de planta.

El análisis del contenido de clorofilas totales es superior, así como el de azúcares: glucosa, fructosa y sacarosa.

Se han utilizado chopos híbridos del clon 7171-B4 procedente del cruce de Populus tremula x Populus alba (Leplé et al., Transgenic poplars: expression of chimeric genes using four different constructs. Plant Cell Rep. 11:137-141, 1992) para introducir la construcción quimérica que contenía el cDNA completo de Dof5 (SEQ ID NO: 1) bajo la acción del promotor constitutivo CaMV 35S del virus del mosaico de la coliflor en un vector binario pBI 121 (Figura 1). La cepa utilizada para la infección fue Agrobacterium tumefaciens EHA-105. La región T-DNA del vector empleado también posee un gen que confiere resistencia al antibiótico kanamicina y que permite la selección de las células recombinantes.

Se transformaron segmentos de hojas de árboles cultivados in vitro y se generaron callos que se seleccionaron por su capacidad de crecimiento y diferenciación en presencia de kanamicina (Figura 2). En las plántulas regeneradas se analizó la presencia del gen CaMV35S-Dof5-NOS mediante Southern blot utilizando como sonda el cDNA de Dof5 (SEQ ID NO: 1) (Figura 3). El proceso de aclimatación de las líneas a tierra se muestra en la Figura 4.

Los estudios de crecimiento y desarrollo indican que los árboles transgénicos presentan mayor crecimiento en altura, mayor diámetro del tallo y de la planta así como mayor biomasa global (Figura 5). El análisis de clorofilas totales se realizó utilizando el método de Arnon: Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiology 24:1-15, 1949 (Figura 6) y reveló un contenido superior tanto de clorofilas totales como de clorofila a y b.

Se ha determinado el contenido de sacarosa, glucosa, fructosa y almidón para establecer si la expresión del transgén era responsable de la variación de los niveles de carbohidratos (Figura 7). El contenido de sacarosa de las líneas aumentó relativo a las plantas control así como los niveles de glucosa y fructosa, este aumento no es debido a hidrólisis espontánea de sacarosa según las condiciones usadas para la realización de la medida. Por tanto, aunque el factor de transcripción fue aislado y caracterizado en el contexto de su función como activador/represor de los genes de Glutamina Sintetasa cuyos productos génicos están implicados en la asimilación de amonio parece estar implicado también en la regulación de genes implicados en el metabolismo carbonado del árbol. Para tener una idea más generalizada sobre el efecto del transgén sobre el transcriptoma de chopo se han realizado análisis de micromatrices comerciales de chopo (Agilent 4x44K) comparando la expresión en líneas transgénicas frente a la expresión del transcriptoma de árboles control... [Seguir leyendo]

1. Árboles transgénicos con mayor crecimiento vegetativo, mayor altura, mayor volumen, mayor diámetro del tronco y contenido en biomasa que los árboles no transformados, caracterizados por la introducción del gen SEQ ID NO: 1.

2. Uso de los árboles transgénicos según la reivindicación 1 para la producción de bioetanol.

3. Uso de la biomasa de los árboles transgénicos según la reivindicación 1 para la industria de la madera o del papel.

4. Uso de la biomasa de los árboles transgénicos según la reivindicación 1 para biorefinerías.