Aptámeros específicos contra el gluten y método de detección del gluten asociado.

Aptámeros específicos contra el gluten y método de detección del gluten asociado.

La presente invención se refiere a unas moléculas de ADN de cadena sencilla

, también denominadas aptámeros, capaces de reconocer y unirse específicamente al gluten, a un método de reconocimiento, captura y/o detección de gluten que emplea dichos aptámeros y a un kit que comprende dichos aptámeros.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201200600.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE OVIEDO.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: DE LOS SANTOS ÁLVAREZ,Noemi, AMAYA GONZÁLEZ,Sonia, LOBO CASTAÑÓN,Mariá Jesús, MIRANDA ORDIERES,Arturo J.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS;... > Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido... > C07H21/04 (con desoxirribosilo como radical sacárido)

PDF original: ES-2436861_A1.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

La presente invención se refiere a unas moléculas de ADN de cadena sencilla, también denominadas aptámeros, capaces de reconocer y unirse específicamente al gluten, y a un método de reconocimiento, captura y/o detección de gluten que emplea dichos aptámeros. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la biotecnología.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La enfermedad celiaca es una enfermedad autoinmune de origen genético, que se caracteriza por un proceso inflamatorio permanente del intestino delgado inducido por la ingestión de las proteínas de almacenamiento (gluten) del trigo (todas las especies denominadas Triticum como el trigo duro, espelta y kamut) , la cebada, el centeno, sus variedades híbridas y probablemente la avena. Según los datos actuales esta enfermedad tiene una prevalencia de aproximadamente el 1 por 100 de la población (S.K. Lee et al. 2006 Curr Opin Rheumatol18, 101-107) . La única terapia efectiva conocida se basa en seguir una dieta exenta de gluten de por vida, lo cual resulta complejo y costoso dado el uso masivo de estos cereales en la alimentación actual. Aunque la relación causal entre la ingesta de gluten y la enfermedad celiaca está perfectamente establecida, no está definida la relación entre la cantidad de gluten ingerida y la gravedad de las manifestaciones clínicas. La variación individual así como la heterogeneidad clínica de los pacientes supone un problema para establecer valores umbral que permitan la protección de todos los individuos susceptibles, ya que incluso trazas de alimentos contaminados con gluten pueden ser perjudiciales para algunos celíacos.

Para satisfacer las necesidades de este sector de la población, la industria alimentaria ha desarrollado una gama de productos con limitadas cantidades de gluten, ya que su supresión total en cereales que lo contienen naturalmente es técnicamente difícil y costosa. Además, existen otros productos que, aunque no contienen gluten de forma natural, pueden resultar contaminados durante su recolección, almacenamiento, procesamiento y/o transporte. La Unión Europea ha homogeneizado las normas sobre la composición y etiquetado de productos alimenticios destinados a este colectivo, basándose en las más recientes directrices de la Comisión del Codex Alimenfarius (Codex Alimenfarius ALlNORM 08/31/REP, Appendix VII, p 107) , que indican un umbral de 20 ppm para alimentos denominados "exentos de gluten", con el fin de que encuentren alimentos adaptados a sus necesidades y nivel de sensibilidad.

Este valor es un compromiso entre la detectabilidad que alcanzan los métodos analíticos actuales basados en ensayos de afinidad con anticuerpos marcados con enzimas y la capacidad tecnológica para reducir la contaminación sin aumentar los costes económicos y medioambientales. Desafortunadamente, este valor no es suficientemente seguro para muchos enfermos celíacos. En 1999, la Federación de Asociaciones de Celíacos de España (FACE) creó la marca de garantía "Controlado por FACE" para aquellos productos que garanticen un valor máximo de 1 O ppm, valor muy próximo a los límites de detección de los métodos actuales.

Los métodos de análisis del gluten se basan en la detección directa de la proteína alergénica. El gluten está formado por cientos de proteínas caracterizadas por su alto contenido en prolina y glutamina y bajos contenidos en aminoácidos con cadenas laterales cargadas. Tradicionalmente se subdivide en dos grandes fracciones según su solubilidad en alcohol:agua (60%) : las solubles prolaminas (gliadina en trigo, hordeína en cebada, secalina en centeno, avenina en avena) y las insolubles gluteninas. Se han identificado diversos fragmentos tóxicos o inmunogénicos en las prolaminas que son resistentes a la digestión por proteasas humanas (R. Ciccocioppo et al. 2005 Clin Exp Immunol 140, 408-416) , aunque estudios recientes apuntan a que las gluteninas también son tóxicas (D.H. Dewar et al. 2006 Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 18, 483-491) . Shan et al. identificaron un péptido de 33 aminoácidos en la a-2-gliadina (L. Shan et al. 2002 Science 297, 2275-2279) que resultó ser inmunodominante (L.Shan et al. 2005 J Proteome Res 4, 1732-1741) . Hoy en día, los métodos estándar para la detección de gluten se basan en ensayos tipo ELlSA, empleando diferentes anticuerpos que reconocen diferentes epítopos de las prolaminas. Sin embargo, los resultados obtenidos dependen fuertemente del anticuerpo así como del material de referencia empleado (R. van Eckert et al. 2010 J. Cereal Sci. 51, 198-204) . El anticuerpo denominado MAb 401.21 desarrollado en 1990 por Skerrit (J.H. Skerritt et al. 1990

J. Agric. Food Chem. 38, 1771-1778) Y descrito en la patente australiana AU572955, se comercializa en un ensayo tipo sándwich aprobado por la AOAC International (Ufhe scienfific associafion dedicafed fo analytical excelence®", (J.H. Skerritt et al. 1991 J. AOAC 74, 257-264) descrito en las solicitudes de patente GB2207921, CA1294903 y AU1891788, aunque no es capaz de cuantificar hordeínas (detecta sólo un 4-5%) , subestima el trigo duro y sobreestima el triticale y las secalinas (T. Thompson et al. 2008 J. Am. Diet. Assoc. 108, 1682-1687) . Tampoco detecta gluten parcialmente hidrolizado debido al formato tipo sándwich. Estudios recientes muestran que también reacciona contra gluteninas (R. van Eckert et al. 2010 J. Cereal Sci. 51, 198-204) . Posteriormente se ha desarrollado el anticuerpo denominado R5, que reconoce el epítopo potencialmente tóxico QQPFP y otras secuencias similares presentes en las prolaminas, incluído el 33mer (L. Sorell et al. Febs Lett 439, 46-50; 1. Valdes et al. 2003 Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 15, 465-474) . El ensayo sándwich con el R5 ha sido designado como método tipo I por el Comité de métodos de análisis y muestreo del Codex Alimentarius (Codex Alimentarius ALlNORM 06/29/23, Appendix 11, p. 40) Y permite la detección de gluten en muestras naturales o procesadas con calor, previa extracción con una disolución que contiene reductores para eliminar los puentes disulfuro intercatenarios que se forman tras el calentamiento (E. Garcia et al. 2005 Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 17, 529-539) descrita en la patente española con número de publicación ES2182698 y familia de patentes (EP1424345, US7585529) . Sin embargo, este método no sirve para medir las prolaminas hidrolizadas. Se han desarrollado otros anticuerpos como el PN3 (H.J. Ellis et al. 1998 Gut 43, 190-195) , el CDC5 (H.M. Nassef et al. 2008 Anal. Chem.

80, 9265-9271) Y el G12 (B. Moron et al. 2008 Am. J. Clin. Nutr. 87405-414; B. Moron et al. 2008 Plos One 3) contra los epítopos tóxicos o immunogénicos comprendidos entre los aminoácidos 31-49, 56-75 Y 57-89 de la a-gliadina, respectivamente.

Con el fin de detectar el gluten hidrolizado, se han propuesto ensayos competitivos, que requieren un único epítopo, y que han sido comercializados usando los anticuerpos R5 descritos en la patente española con número de publicación ES2304874 (ver también W02008110655) y G12. Sin embargo, estos métodos no son compatibles con el procedimiento de extracción anteriormente citado debido a que desnaturalizan los anticuerpos y marcadores enzimáticos durante la inevitable incubación entre la muestra y el único anticuerpo de detección usado.

Los aptámeros son un tipo de receptor molecular no proteico, son estables térmica y químicamente en condiciones extremas y, por tanto, constituyen una alternativa prometedora respecto a los anticuerpos. Los aptámeros son oligonucleótidos que se seleccionan in vitro mediante un método combinatorio denominado SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) y se caracterizan por presentar una gran afinidad y especificidad hacia un ligando determinado... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una molécula de ADN de cadena sencilla, donde dicha secuencia reconoce y se une específicamente a un péptido que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO:1.

2. La molécula de ADN según la reivindicación 1, caracterizada por que dicha molécula reconoce y se une específicamente al gluten.

3. La molécula de ADN según la reivindicación 2, donde dicho gluten es de trigo, cebada, centeno o avena.

4. La molécula de ADN según la reivindicación 3, donde dicho gluten es de trigo.

5. La molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, donde dicha molécula reconoce y se une específicamente a gliadina, hordeína, secalina o avenina.

6. La molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicha molécula reconoce y se une específicamente a gliadina.

7. La secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicha secuencia es incapaz de reconocer y unir específicamente proteínas de maíz, soja o arroz.

8. La secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicha secuencia comprende la secuencia nucleotídica X-GTCT-Y, donde X comprende entre 3 y 29 nucleótidos e Y comprende entre 7 y 33 nucleótidos.

9. La secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde dicha secuencia comprende una secuencia nucleotídica que se selecciona de entre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6,

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.

10. La secuencia de AON según la reivindicación 9, donde dicha secuencia se une a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 con una constante de disociación Ko igualo menor de 55 nM.

11. La secuencia de AON según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde dicha secuencia comprende la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 2.

12. La secuencia de AON según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde dicha secuencia comprende la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 7.

13. La secuencia de AON según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde dicha secuencia comprende además una molécula marcadora.

14. La secuencia de AON según la reivindicación 13, donde dicha molécula marcadora se selecciona de entre un fl u o rófo ro , una enzima, un péptido, una nanopartícula, una molécula electroactiva, una digoxigenina y una biotina.

15. La secuencia de AON según la reivindicación 14, donde dicha molécula electroactiva se selecciona de entre azul de metileno, ferroceno, antraquinona y tionina.

16. La secuencia de AON según la reivindicación14, donde dicho fluoróforo se selecciona de entre fluoresceína, boro-dipirrometeno, cianina, naftaleno y rodamina.

17. La secuencia de AON según la reivindicación 14, donde dicha enzima se selecciona de entre peroxidasa, fosfatasa alcalina, ONAzimas y NAOH deshidrogenasas.

18. La secuencia de AON según la reivindicación 14, donde el péptido se selecciona de entre una polihistidina, un epítopo myc y un epítopo flag.

19. La secuencia de AON según la reivindicación 14, donde dicha nanopartícula se selecciona de entre una nanopartícula metálica, nanopartícula semiconductora y micro o nanopartícula magnética.

20. La secuencia de AON según la reivindicación 14, donde la molécula marcadora es biotina.

21. La secuencia de AON según la reivindicación 14, donde la molécula marcadora es digoxigenina.

22. La secuencia de AON según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, donde al menos un enlace fosfodiéster de dicha secuencia contiene al menos un O sustituido por un S.

23. Un kit para la detección de gluten caracterizado por que comprende al menos una secuencia de AON de cadena sencilla según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.

24. El kit según la reivindicación 23, caracterizado por que además comprende un soporte sólido.

25. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 23 o 24, donde la secuencia de AON está anclada al soporte sólido.

26. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 23 o 24, que además comprende el péptido con SEQ ID NO: 1 o gliadina o gluten, anclado al soporte sólido.

27. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, donde además comprende un anticuerpo que reconoce y se une específicamente a gluten.

28. Uso de la secuencia de ADN de cadena sencilla según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o del kit según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, para la detección del gluten.

29. Un método de detección del gluten que comprende las siguientes etapas: a) poner en contacto una secuencia de ADN de cadena sencilla según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 con una muestra problema; y b) detectar la presencia del complejo formado por dicha secuencia y el gluten de la muestra problema en la etapa (a) .

30. El método según la reivindicación 29, donde la etapa (a) se lleva a cabo en disolución.

31. El método según la reivindicación 29, donde la etapa (a) se lleva a cabo en un soporte sólido.

32. El método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, donde la etapa

(b) se lleva a cabo mediante peR.

(b) se lleva a cabo mediante un aptaensayo.

33. El método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, donde la etapa 34. El método según la reivindicación 33, donde el aptaensayo es un ELOSA.

FIG.1A

70 60

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O RO R1 R2 R3 R4

Ronda FIG.1B

R5 R6 R9 R10

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FIG.3

Tiempo (min)

0.03

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ro ~009

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0.7

0.6

0.5

O

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-

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0.2 01

0.0

Oll 05 10 1 S 2.0

Relación molar

005 (/) 010

ro ~ 015

0.20

025 06

0.5

O

E

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Tiempo (min)

60

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\S 11<

05 10 15 20

Relación molar

FIG.4A

... SEQIDNO:7

... /l. ...

SECID NO:5

- G--SECIDNO:8 •

-

~

- B-SECID NO:2

e..... 100

ca ··e·· SECID NO:9

"t:I

ca SECID NO:10

N 80

MM'.M'

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e CI) 60

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u l!

LL 20

O -1 O 1 2 3 4

log ([apt] I nM)

FIG.4B

- O 1 2 3 4 log ([apt] /nM)

-100

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e 60

(])

e :Q 40

u u ro O

-. SECIDNO:7 ···6····SECID NO:5

- 6-SECID NO:8

----SECID NO: 2 ... g ... SECIDNO:9

_120 '#. 100ca "'C ca 80N J!! c: 60 Q) c: 40~O OO 20 ~ u.. O -1 .. -9-III SEQIONO:7 SEQIONO:8 SEQIONO:2 o o _..... -----."".."...• o 1 2 101 ( (apt] ¡"M) 3 o 4

FIG.5B

0, 6

0, 5 ......... SEQIDNO:7

- 0, 4

~ -0, 3

0, 2 0, 1 •

O -1 O 1 2 3 4

lag Uapt] I nM)

FIG.5A

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Universidad de oviedo

<120> APTÁMERO ESPECÍFICOS CONTRA EL GLUTEN Y MÉTODO DE DETECCIÓN DEL GLUTEN ASOCIADO

<130> Es1624. 4

<160> 20

<170> Patentln version 3.5

<210> <211> <212> <213> 1 33 PRT Triticum aestivum

<400> 1

Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu pro Tyr Pro Gln 1 5 10 15 Pro

Gln Leu Pro Tyr Pro Gln pro Gln Leu Pro Tyr pro Gln pro Gln 20 25 30 Pro

Phe

<210> <211> <212> <213> 2 40 DNA secuencia artificial

<220> <223> Secuencia artificial que une específicamente SEQ ID NO: 1.

<400> 2 ctaggcgaaa tatagctaca actgtctgaa ggcacccaat 40

<210> <211> <212> <213> 3 40 DNA Secuencia artificial

<220> <223> secuencia artificial que une específicamente SEQ ID NO: 1

<400> 3 ctaggcgaga tatagctaca actgtctgaa ggcacctaat 40

<210> <211> <212> <213> 4 40 DNA Secuencia artificial

<220> <223> Secuencia artificial que une específicamente SEQ ID NO: 1

<400> 4 actgtctgaa ggtaatgctg gcattgactc tgcaacaatc 40

Página 1

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial que une específicamente SEQ ID NO: 1

<400> 5 cccgtctgag gaattaggaa tcgtccatta aactgcttct 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial que une específicamente SEQ ID NO: 1

<400> 6

ccccgtgcca atgaccagta atgtgtctcg aaccttaaat 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial que une específicamente SEQ ID NO: 1

<400> 7 ccagtctccc gtttaccgcg cctacacatg tctgaatgcc 40

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial que une específicamente SEQ ID NO: 1

<400> 8 cggtaagtgg tctaaagcgt ctgagcgatc gtatcggccc 40

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial que une específicamente SEQ ID NO: 1

<400> 9 aattctgtct cggtccaaat tgtaaaacat ggtgtcaacc 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia artificial que une específicamente SEQ ID NO: 1

página 2

<400> 10 gctcagccgt ctccgccccg acgtagtgaa actctcaact 40

<210> <211> <212> <213> 11 20 DNA secuencia artificial

<220> <223> cebador directo clonación

<400> 11 gctgcagctg caaccatttc 20

<210> <211> <212> <213> 12 22 DNA secuencia artificial

<220> <223> cebador inverso clonación

<400> 12 ataaatggtt gcggctgcgg at 22

<210> <211> <212> <213> 13 91 PRT secuencia artificial

<220> <223> <400> péptido recombinant.

3. mer con cola de histidinas 13

Met 1 Leu Gln Leu Gln pro Phe pro Gln pro Gln Leu 5 10 pro Tyr pro Gln 15

pro Gln Leu pro Tyr pro Gln pro Gln Leu 20 25 pro Tyr pro Gln Pro Gln 30

pro phe rle Ser Arg Glu Leu val 35 40 ASp pro Asn Ser val 45 Gln Ala Arg

Leu Gln ASp val 50 ASp Gly Thr rle ASp Thr Arg Ser Lys Leu Ala Ala 55 60

Ala Gln Leu Tyr Thr Arg Ala Ser Gln pro Glu Leu Ala pro Glu ASp65 70 75 80

pro Glu ASp Leu Glu His His His His His His 85 90

<210> <211> <212> <213> 14 58 PRT Secuencia artificial

<220>

página 3

<223> péptido control: Cola de histidinas del péptido recombinant.

3. mer

<400> 14

Met Ile Ser Arg Glu Leu val ASp pro Asn Ser val Gln Ala Arg Leu 1 5 10 15

Gln ASp Val ASp Gly Thr Ile ASp Thr Arg Ser Lys Leu Ala Ala Ala 20 25 30

Gln Leu Tyr Thr Arg Ala Ser Gln pro Glu Leu Ala pro Glu ASp pro35 40 45

Glu ASp Leu Glu Hi s Hi s Hi s Hi s Hi s Hi s 50 55

<210> 15

<211> 80

<212> DNA

<213> Secuencia arti fi ci al

<220>

<223> Colección de ADN inicial

<220>

<221> misc_feature

<222> (21) .. (60)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 15

agggttgata ggttaagagc nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 cgatgtcaac tagctgttgg 80

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo amplificación <400> 16

agggttgata ggttaagagc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso biotinilado <220>

<221> misc_binding

<222> (1) .. (1)

<223> biotina- (CH2) 6

<400> 17

página 4

ccaacagcta gttgacatcg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo marcado con 6-FAM

<220>

<221> misc_binding

<222> (1) .. (1)

<223> 6-FAM

<400> 18

agggttgata ggttaagagc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso amplificación <400> 19 ccaacagcta gttgacatcg 20

<210> 20

<211> 100

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 20 gctgcagctg caaccatttc cgcagccgca actaccatat ccgcagccgc aactaccata 60

tccgcagccg caactaccat atccgcagcc gcaaccattt 100

Página 5