Apoptosis provocada por el anticuerpo monoclonal anti-Her2.

Un anticuerpo o fragmento del mismo que induce apoptosis en células que expresan Her2 y reconoce un epítopoextracelular sobre un polipéptido Her2.

Apoptosis provocada por el anticuerpo monoclonal anti-Her2.

Campo de la invención La presente invención se relaciona con anticuerpos anti-Her2 y, más concretamente, con anticuerpos anti-Her2 que inducen apoptosis en células que expresan Her2.

Antecedentes de la invención El oncogén Her2 codifica para una glicoproteína asociada a membrana a la que se hace referencia como p185HER-2 que tiene actividad tirosina kinasa. Her2 es un miembro de la subfamilia de los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) , que incluye el receptor EGF y los receptores Her3 y Her4 (Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA

86, 9193-9197 (1989) ; Plowman et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90, 1746-1750 (1993) ) . La secuencia de Her2 fue descrita por Semba et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6497-6501 (1985) ) ; Coussens et al. (Science 230, 974-976 (1985) ) . Schecter et al. describieron un gen de rata relacionado (Nature 312, 515-516 (1984) ) .

Se ha descrito una mayor expresión del oncogén Her2 en células y líneas celulares tumorales por parte de varios grupos (Coussens et al., antes citado; King et al., antes citado) . La mayor expresión de Her2 se produce como resultado de amplificación génica o de una mayor expresión del gen de copia única. Estas observaciones sugerían que Her2 puede ser sobreexpresado en tejido canceroso humano. Slamon et alaboradores (Slamon et al., Science 235, 177-182 (1987) ; Slamon et al., Science 244, 707-712 (1989) ) examinaron los niveles de expresión de Her2 en tumores tomados de una gran muestra de pacientes de cáncer de mama y de ovario. Se vio que casi un 30% de esas pacientes tenían amplificación y sobreexpresión del gen Her2, lo cual estaba asociado a un pobre desenlace clínico (aumento de las recidivas y baja razón de supervivencia) , particularmente en pacientes de cáncer de mama positivo en nódulos. Las correlaciones dadas por Slamon han sido confirmadas en una serie de estudios (véanse, por ejemplo, Ro et al., Cancer Res. 49, 6941-6944 (1989) ; Walker et al., J. Cancer 60, 426-429 (1989) ; Wright et al., Cancer Res. 49, 2087-2090 (1989) ; Berchuck et al., Cancer Res. 50, 4087-4091 (1990) ; Kallioniemi et al., Int. J. Cancer 49, 650-655 (1991) ; Rilke et al., Int. J. Cancer 49, 44-49 (1991) ) .

La presencia de ciertos factores, tales como la sobreexpresión de Her2, que son indicativos de un pobre pronóstico, puede sugerir que es apropiada la terapia adyuvante después de la extirpación quirúrgica. La terapia adyuvante puede incluir quimioterapia a altas dosis y trasplante autólogo de médula ósea. Se ha descrito recientemente (Muss et al., N. Engl. J. Med. 330, 1260-1266 (1994) ) que las pacientes de cáncer de mama que tienen tumores que exhiben sobreexpresión de Her2 disfrutaban de beneficios significativos gracias a la terapia adyuvante.

Por analogía con otras proteínas tirosina kinasas de receptores, se supone que un ligando para Her2 estimula la fosforilación de los receptores. Se ha descrito que una serie de factores polipeptídicos aumentan la fosforilación de la tirosina de Her2 y se supuso que eran un ligando (Wen et al., Cell 64, 559-572 (1992) ; Holmes et al., Science 256, 1205-1210; Marchionni et al., Nature 362, 312-318 (1993) ; Falls et al., Cell 72, 801-815 (1993) ) . Sin embargo, no existe evidencia de que ninguno de estos factores sea un ligando verdadero que se une directamente a Her2 y estimula la fosforilación de los receptores. Una aproximación para salvar la presencia de ligando es generar un anticuerpo monoclonal (“mAb”) de tipo ligando. Varios grupos han generado mAbs anti-Her2 usando un receptor

Her2 de la superficie celular o un dominio extracelular purificado del receptor Her2 (Yarden, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2569-2573 (1990) ; Hanwerth et al., Br. J. Cancer 68, 1140-1145 (1993) ; Srinivas et al., Cancer Immunol. Immunother. 36, 397-402 (1993) ; Stancovaski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8691-8695 (1991) ) . Estos mAbs estimulaban la fosforilación de la tirosina de Her2 de células con sobreexpresión, pero no fueron totalmente caracterizados en términos de unión a, y fosforilación de, cada uno de Her2, Her3 o Her4 o en términos de la activación de la kinasa en células transfectadas con Her2.

Deshane J et al. (1995) J. Invest. Med. 32 (supl. 2) : 328A describe supresión de anticuerpo intracelular de la oncoproteína erbB-2 y el truncamiento dirigido de dianas tumorales por inducción de apoptosis.

Grim et al. (1994) Cancer Gene Therapy 1 (4) : 333-334 describe inducción de muerte celular apoptótica en células tumorales que sobreexpresan erbB-2 de diversos subtipos histológicos mediados por localización intracelular de un SSV anti erbB-2.

Curiel DT et al. (1995) Cancer Gene Therapy 2 (supl. 1) : S20 describe la expresión intracelular de un anticuerpo monocatenario (sFv) sFv anti erbB-2 y la inducción de apoptosis.

Se han descrito con anterioridad los efectos inhibitorios del crecimiento de mAbs anti-Her2 sobre células de cáncer de mama (Tagliabue et al., Int. J. Cancer 47, 933-937 (1991) ; Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9, 1165-1172 (1989) ; Drevin et al., Oncogen 2, 387-394 (1988) ; Fendly et al., Cancer Res. 50, 1550-1558 (1990) , Hanwerth et al., antes 65 citado; véase también la revisión de Vitetta y Uhr, Cancer Res. 54, 5301-5309 (1994) ) , pero estos efectos fueron interpretados como citostáticos, ya que la eliminación del anticuerpo permitía reanudar el crecimiento celular. Xu et

al. (Int. J. Cancer 53, 401-408 (1993) ) describieron anticuerpos anti-Her2 que eran citotóxicos para el crecimiento de células tumorales independientes de anclaje.

Se describió un mAb anti-receptor de EGF que inducía la apoptosis en la línea celular de carcinoma colorrectal

humano, DiFi, que sobreexpresa el receptor de EGF, y que inducía cambios morfológicos a concentraciones de 5 a 20 nM. Estos efectos fueron interpretados en términos de bloqueo de la unión del EGF al receptor afín por el mAb competitivo y de falta de la actividad mitogénica del mAb (Wu et al., J. Clin. Invest. 95, 1897-1905 (1995) ) .

La apoptosis, o muerte celular programada, es una forma de muerte celular caracterizada por encogimiento de la célula y fragmentación del ADN. El colapso del núcleo celular es aparente, ya que la cromatina se fragmenta en unidades mononucleosómicas simples o múltiples, un proceso mediado por una endonucleasa endógena. La apoptosis es distinta de la muerte celular necrótica, que da lugar a hinchamiento celular y liberación de los componentes intra-celulares (Kerr et al., Br. J. Cancer 26, 239-257 (1972) ; Wyllie et al., Int. Rev. Cytol. 68, 251-306 (1980) ; Wyllie, Nature 284, 555-556 (1980) ) . Las células apoptóticas, sin liberar dichos componentes, son fagocitadas y por tanto degradadas (Savill et al., Nature 343, 170-173 (1990) ) . Por lo tanto, la apoptosis da lugar a un proceso eficiente para la eliminación de células no viables por los propios mecanismos de defensa del huésped.

Es un objeto de la invención generar anticuerpos para Her2 que inducen apoptosis en células que expresan Her2 y de este modo “marcan” dichas células para su eliminación del huésped. Los anticuerpos son útiles para inducir apopto-sis en tumores. Esto representa un perfeccionamiento substancial con respecto a la terapia de anticuerpos actualmente disponible para el cáncer, que conlleva típicamente la muerte de las células tumorales por anticuerpos junto con un agente citotóxico. Los agentes citotóxicos producen generalmente efectos colaterales no deseados, que, si son graves, pueden dar lugar a una reducción o interrupción del tratamiento. La presente aproximación permite la muerte de las células tumorales por el sistema inmune del huésped, evitando así los efectos de los agentes citotóxicos y la necrosis de las células tumorales inducida por dichos agentes.

Sumario de la invención Se proporcionan por la invención anticuerpos que inducen apoptosis en células que expresan Her2 y que reconocen un epítopo extracelular en un polipéptido de Her2. Se ha visto que un anticuerpo que estimula la fosforilación de los receptores Her2 en líneas celulares tiene también el efecto inesperado de inducir cambios en células que expresan Her2 caracte-rísticos de la apoptosis. Estos cambios incluyen fragmentación del ADN y pérdida de la viabilidad y se observan en la población de células tratadas en 24 horas. Dicho anticuerpo es útil para marcar células que sobreexpresan Her2 para su eliminación por los mecanismos de defensa del huésped.

Los anticuerpos de la invención pueden reconocer un epítopo en Her2 que es reconocido por el anticuerpo mAb74. El epítopo era distinto de los epítopos reconocidos por... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo o fragmento del mismo que induce apoptosis en células que expresan Her2 y reconoce un epítopo extracelular sobre un polipéptido Her2. 5

2. El anticuerpo de la Reivindicación 1, que es un anticuerpo monoclonal.

3. El anticuerpo de la Reivindicación 1, que es un anticuerpo humanizado.

4. El anticuerpo de la Reivindicación 1, que es un anticuerpo humano.

5. Una línea celular de hibridoma capaz de producir el anticuerpo de la Reivindicación 1.

6. El anticuerpo de la Reivindicación 1, donde el fragmento es un fragmento F (ab) o Fab’. 15

7. Un método in vitro para inducir apoptosis en células que expresan Her2, consistente en administrar el anticuerpo de la reivindicación 1.

8. El método in vitro de la Reivindicación 7, donde las células son células tumorales. 20

9. Uso del anticuerpo de la Reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para inducir apoptosis en células que expresen Her2.

10. El uso de acuerdo con la Reivindicación 9, donde las células son células tumorales. 25

11. Una composición farmacéutica consistente en un anticuerpo de la Reivindicación 1 en una mezcla con un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

12. La composición de la Reivindicación 11, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 30

13. La composición de la Reivindicación 11, donde el anticuerpo es anticuerpo humanizado.

14. La composición de la Reivindicación 11, donde el anticuerpo es un anticuerpo humano.