Aparato de detección para controlar la amplificación de ácido nucleico, usando un transistor de efecto de campo sensible a iones (ISFET) para detectar el pH.

Un aparato de detección para controlar la amplificación de ácido nucleico en una muestra,

que comprende: unsustrato de silicio que integra uno o más elementos térmicos dispuestos para calentar una muestra, y más de unacámara de reacción que contiene un ISFET, cada una con un ISFET para medir el pH de dicha muestra.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10174104.

Solicitante: DNA Electronics Ltd.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: Ugli Campus Block C, 56 Wood Lane London W12 7SB REINO UNIDO.

Inventor/es: TOUMAZOU,Christofer, OU,CHUNG-PEI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N27/414 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 27/00 Investigación o análisis de materiales mediante el empleo de medios eléctricos, electroquímicos o magnéticos (G01N 3/00 - G01N 25/00 tienen prioridad; medida o ensayo de variables eléctricas o magnéticas o de las propiedades eléctricas o magnéticas de los materiales G01R). › Transistores de efecto de campo sensibles a los iones o a los agentes químicos, es decir ISFETS o CHEMFETS.

PDF original: ES-2440572_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Aparato de detección para controlar la amplificación de ácido nucleico, usando un transistor de efecto de campo sensible a iones (ISFET) para detectar el pH 5

Campo de la invención La presente invención se refiere al control cuantitativo en tiempo real de la amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , amplificación mediada por transcripción o reacción en cadena de la ligasa, empleando un transistor de efecto de campo sensible a iones (ISFET, Ion Sensitive Field Effect Transistor) sensible a pH para detectar la liberación de protones resultante de la extensión de cebadores a medida que avanza la amplificación. Para esta finalidad, la invención proporciona un aparato de detección que incluye un ISFET sensible a pH.

Antecedentes de la invención La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR o RT-PCR) se ha convertido en un estándar de hecho para la amplificación de pequeñas cantidades de ADN o ARN, por ejemplo, para la clonación de secuencias de genes, pruebas forenses y pruebas genéticas para mutaciones relacionadas con enfermedades. La mayoría de las realizaciones de qPCR requieren sondas marcadas (por ejemplo, tintes fluorescentes) para detectar amplicones. La qPCR descrita en la presente memoria evita la necesidad de usar sondas marcadas. En cambio, se basa en un ISFET sensible a pH que detecta la liberación de protones resultado del ciclo de la PCR y por lo tanto puede realizarse en una microplaca.

Como se informó en la Solicitud de Patente Internacional Publicada WO 03/073088, los autores de la presente invención descubrieron anteriormente que los ISFET podían usarse para controlar la liberación de protones asociada con la inserción de nucleótidos individuales en el extremo de una cadena oligonucleotídica. El control de inserciones de nucleótidos individuales mediante un ISFET sensible a pH puede utilizarse en la secuenciación de ADN basada en la secuenciación de ADN del método de Sanger convencional y en la identificación de variantes alélicas, por

ejemplo, polimorfismos mononucleotídicos (SNP, Single Nucleotide Polymorphisms) , que dependen de la detección de la extensión de cebadores oligonucleotídicos diseñados hacia sitios de ácido nucleico específicos diana. La presente invención surge de la concienciación adicional de los inventores de que los protones también son un producto de la PCR y que, por tanto, la qPCR puede realizarse mediante control ISFET de la liberación de protones, preferentemente en una cámara de reacción de bajo volumen.

El documento WO2005/075638 describe el uso de un GenFET con una sonda inmovilizada para detectar un gen diana, que si está presente, produce un ácido nucleico cargado en contacto con la superficie. Toda la matriz GENFET se expone a un volumen que contiene una muestra que contiene el gen.

Resumen de la invención Por lo tanto, se describe un método de control de la amplificación de ácido nucleico en una muestra que comprende una mezcla de amplificación de ácido nucleico tamponada para la amplificación de la secuencia diana si está presente en la muestra, caracterizado por que dicho control es por medio de la detección de cambio de pH

resultante de la liberación de protones en presencia de la secuencia diana según avanza la amplificación más allá de un umbral de número de ciclos para la capacidad tampón de la muestra a superar, dicha detección que emplea un aparato de detección que comprende un ISFET que tiene una superficie detectora se expone a la mezcla y dispuesta para generar una señal de salida eléctrica en respuesta al cambio de pH en dicha superficie de transistor y medios para detectar una señal de salida eléctrica del ISFET. Para conseguir el grado de sensibilidad requerido en 50 la detección, la amplificación se realizará preferentemente en pequeños (preferentemente nano) volúmenes y a una capacidad de tampón baja de tal manera que el número de protones liberados conduce a un cambio rápido en el pH a medida que se supera la capacidad del tampón de la muestra. Por tanto, dicho método puede realizarse ventajosamente en un nanoreactor con un ISFET sensible a pH integrado proporcionado en un dispositivo o microplaca microfluídicos.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un aparato de detección para el control de la amplificación de ácido nucleico en una muestra que comprende un sustrato de silicio que integra uno o más elementos térmicos dispuestos para calentar una muestra y más de una cámara de reacción conteniendo SFET, cada una con un ISFET para medir el pH de dicha muestra.

Preferentemente una superficie de detección de uno o más ISFET está provista de una capa de nitruro de silicio. De manera preferente, el aparato de detección comprende adicionalmente uno o más detectores de temperatura y, en una opción preferida, los detectores de temperatura pueden estar dispuestos para controlar uno o más elementos térmicos para controlar la temperatura de la muestra.

Las cámaras de reacción reciben preferentemente la muestra en o sobre una base, o el aparato comprende adicionalmente canales para recibir la muestra en o en una base. Cámaras de reacción de 1 pl a aproximadamente 10 μl contienen dicha muestra y superpuestos los uno o más ISFET.

La muestra puede hacerse fluir a través de un canal o una cámara de un dispositivo microfluídico y, a medida que fluye, se somete consecutivamente a diferentes temperaturas mediante las que se realiza el termociclado para la PCR. La muestra puede hacerse fluir a través de una cámara o un canal que atraviesa consecutivamente diferentes zonas de temperatura adecuadas para dicho termociclado. La muestra puede hacerse fluir a través de un canal que atraviesa consecutivamente diferentes zonas de temperatura previstas en la base de dicho dispositivo microfluídico, siendo dichas zonas adecuadas para las repeticiones sucesivas a lo largo del canal de las etapas de desnaturalización, hibridación de cebadores y extensión de cebadores de la PCR.

Preferentemente, para detectar el cambio de pH de la muestra en diferentes posiciones a lo largo de dicho canal, se emplea más de un ISFET. La muestra puede moverse hacia atrás y hacia adelante en una microcámara entre zonas de temperatura requeridas para el termociclado y dicho ISFET se proporciona en una pared de dicha cámara. Preferentemente, al menos uno de: un electrodo de referencia, un FET de referencia que tiene una capa no enzimática unida, y un detector de conductividad; se integran después con el sustrato de silicio.

Adicionalmente, el aparato de detección puede comprender reactivos para la amplificación de ADN. Los reactivos pueden ser ADN, incluyendo opcionalmente sondas de captura de ADN diana en la muestra, inmovilizados sobre perlas. Los reactivos también pueden deshidratarse y situarse dentro de una cámara de reacción o disponerse para introducirse en la cámara de reacción con la muestra.

El documento WO 03/054225 describe (véase la Figura 3, página 15-16) un sistema en el que la hibridación se realiza en una zona rebajada creada por la capa de grabado 7. El volumen restante permite que el fluido se mezcle libremente a su alrededor. Por tanto, la técnica anterior describe a lo sumo una cámara, que es el volumen encerrado por encima de la matriz de detectores.

Breve descripción de los dibujos Las realizaciones específicas de la invención se describirán ahora a modo de ejemplo solo con referencia a las figuras adjuntas, en las que:

La Figura 1 muestra los cambios de pH que se producen durante la extensión de la cadena de ADN usando un 35 medio de reacción tamponado.

La Figura 2 es un diagrama esquemático de un transistor de efecto de campo como el previamente utilizado para la secuenciación de ADN.

La Figura 3 es un diagrama esquemático de un par de transistores de efecto de campo como el previamente empleado para la secuenciación de ADN.

La Figura 4 es una representación esquemática de resultados obtenidos usando el par de transistores de efecto de campo para la determinación de la secuencia de ADN de tipo Sanger en un molde de ADN empleando todos 45 los dNTP requeridos y un solo ddNTP en la mezcla de reacción.

La Figura 5 muestra diagramáticamente el ciclo de la PCR resultante en la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana.

La Figura 6 muestra la liberación de protones mediante extensión de ADN controlada aplicando la invención para la determinación de la secuencia de ADN.

La Figura 7 muestra resultados de la PCR en tiempo real cuantitativa simulada usando ISFET sensible a pH.

La Figura 8 es un diagrama esquemático... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un aparato de detección para controlar la amplificación de ácido nucleico en una muestra, que comprende: un sustrato de silicio que integra uno o más elementos térmicos dispuestos para calentar una muestra, y más de una 5 cámara de reacción que contiene un ISFET, cada una con un ISFET para medir el pH de dicha muestra.

2. Un aparato de detección de acuerdo con la reivindicación 1, en el que una superficie de detección de los ISFET está provista de una capa de nitruro de silicio.

3. Un aparato de detección de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que adicionalmente comprende uno o más detectores de temperatura.

4. Un aparato de detección de acuerdo con la reivindicación 3, en el que los detectores de temperatura se disponen para controlar el uno o más elementos térmicos para controlar la temperatura de la muestra. 15

5. Un aparato de detección de acuerdo con la reivindicación 1, en el que cámaras de reacción de 1 pl a aproximadamente 10 μl contienen dicha muestra y superpuestos los ISFET.

6. Un aparato de detección de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se hace fluir la muestra a través de las

cámaras de reacción del dispositivo microfluídico, y a medida que la muestra fluye se somete consecutivamente a diferentes temperaturas de tal manera que se obtiene un ciclado térmico para la PCR.

7. Un aparato de detección de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicha muestra se hace fluir a través de las cámaras de reacción de tal manera que atraviesa consecutivamente diferentes zonas de temperatura adecuadas 25 para dicho termociclado.

8. Un aparato de detección de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicha muestra se desplaza hacia atrás y hacia adelante en las cámaras de reacción entre las zonas de temperatura requeridas para el termociclado y proporcionándose dicha ISFET en una pared de cada una de dichas cámaras.

9. Un aparato de detección de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que adicionalmente integra con el sustrato de silicio al menos uno de: un electrodo de referencia, un FET de referencia que tiene una capa unida no enzimática y un detector de conductividad.

10. Un aparato de detección de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que adicionalmente comprende reactivos para la amplificación de ADN.

11. Un aparato de detección de acuerdo con la reivindicación 10, siendo los reactivos ADN, comprendiendo opcionalmente sondas para capturar el ADN diana en la muestra, y estando inmovilizados sobre perlas. 40

12. Un aparato de detección de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo adicionalmente reactivos para la amplificación de ADN, estando dichos reactivos deshidratados y situados en una cámara de reacción o dispuestos para introducirse en la cámara de reacción con la muestra deshidratada en el interior de la cámara de reacción o para introducirse con la muestra.


 

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