Antígenos neisseriales conservados.

Una proteína que comprende un fragmento antigénico de la proteína 953 neisserial MKKIIFAALAAAAVGTASATYKVDEYHANVRFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITI PVANLQSGSQPFTGHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMRGKTAPVKLKAEKFN CYQSPMAETEVCGGDFSTTIDRTKWGVDYLVNAGMTKNVRIDIQIEAAKQ;

MKKIIFAALAAAAISTASAATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDIT IPIANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKF NCYQSPMEKTEVCGGDFSTTIDRTKWGMDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ; o MKKIIIAALAAAAIGTASAATYKVDEYHANARFSIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDIT IPVANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKF NCYSPMLKTEVCGGDFSTTIDRTKWGMDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ, siempre que dicha proteína no comprenda la secuencia MKKIIFAALAAAAVGTASATYKVDEYHANVRFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIP VANLQSGSQPFTGHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMRGKTAPVKLKAEKFNCY QSPMAETEVCGGDFSTTIDRTKWGVDYLVNAGMTKNVRIDIQIEAAKQ;

MKKIIFAALAAAAISTASAATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITI PIANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNC YQSPMEKTEVCGGDFSTTIDRTKWGMDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ; o

MKKIIIAALAAAAIGTASAATYKVDEYHANARFSIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITI PVANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNC YSPMLKTEVCGGDFSTTIDRTKWGMDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ, y en donde el mencionado fragmento comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

(a) ATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIP (I/V) ANLQSGS QHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPM; o

(b) KTEVCGGDFSTTIDRTKWG (M/V) DYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ.

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invenciïn se refiere a antïgenos de bacterias del gïnero Neisseria conservados.

ANTECEDENTES DE LA TïCNICA

Las bacterias Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae son diplococos gram negativos, inmïviles, que son patïgenos en seres humanos. Basïndose en el polisacïrido capsular del organismo, se han identificado 12 serogrupos de N. meningitidis. El grupo A es el patïgeno mïs frecuentemente implicado en enfermedades epidïmicas en el ïfrica subsahariano. Los serogrupos B y C son los responsables de la inmensa mayorïa de los casos en los Estados Unidos y en païses mïs desarrollados. Los serogrupos W135 e Y son responsables del resto de los casos en los Estados Unidos y en païses desarrollados.

La vacuna meningocïcica actualmente en uso es una vacuna polisacïrida tetravalente compuesta por los serogrupos A, C, Y y W135. Sin embargo, esta estrategia no puede usarse para el Meningoco B, porque el polisacïrido capsular del menB es un polïmero de ïcido N-acetil neuramïnico unido a a (2-8) que estï tambiïn presente en el tejido de mamïferos. Una estrategia de una vacuna para el menB utiliza mezclas de proteïnas de membrana externa (PME) . Para superar la variabilidad antigïnica, se han construido vacunas multivalentes que contienen hasta nueve porinas diferentes [por ejemplo, Poolman (1992) Development of a meningococcal vaccine. Infect. Agents Dis. 4: 13-28]. Otras proteïnas utilizadas en vacunas de membrana externa han sido las proteïnas opa y opc, pero ninguna de estas estrategias han podido superar la variabilidad antigïnica [por ejemplo, Ala’Aldeen y Borriello (1996) The meningococcal transferrin-binding proteins 1 and 2 are both surface exposed and generate bactericidal antibodies capable of killing homologous and heterologous strains. Vaccine 14 (1) : 49-53].

En los documentos WO99/24578, WO99/36544, WO99/57280 y WO00/22430 se desvela una gran cantidad de proteïnas y secuencias de nucleïtidos de Neisseria.

Tettelin y col. en [Science (2000) 287: 1809-1815] desvelan datos exhaustivos de secuencias de la cepa MC58.

DESCRIPCIïN DE LA INVENCIïN

Para garantizar un reconocimiento y una reactividad mïximos de cepas cruzadas, pueden usarse regiones de proteïnas que estïn conservadas entre diferentes especies, serogrupos y cepas de Neisseria. Por lo tanto, la invenciïn proporciona proteïnas que comprenden tramos de secuencias de aminoïcidos compartidos en la mayor parte del gïnero Neisseria, particularmente en N. meningitidis y N. gonorrhoeae.

La invenciïn proporciona una proteïna que comprende un fragmento de una proteïna Neisserial como se define en las reivindicaciones.

El fragmento comprende una regiïn antigïnica o inmunogïnica de la proteïna Neisserial.

Un aminoïcido “conservado” es un aminoïcido que, en una proteïna de Neisseria concreta, estï presente al menos en un x % de Neisseria. El valor de x puede ser de 50% o mayor, por ejemplo de 66%, 75%, 80%, 90%, 95% o incluso de 100% (es decir, el aminoïcido se encuentra en la proteïna en cuestiïn en todo el gïnero Neisseria) .

Para determinar si un aminoïcido estï “conservado” en una proteïna Neisserial concreta, es necesario comparar este resto de aminoïcido en las secuencias de la proteïna en cuestiïn a partir de una pluralidad de diferentes especies de Neisseria (una “poblaciïn de referencia”) . La poblaciïn de referencia puede incluir diversas especies de Neisseria diferentes (preferentemente N. meningitidis y N.gonorrhoeae) o puede incluir una sola especie. La poblaciïn de referencia puede incluir diversos serogrupos diferentes de una especie concreta (tales como los serogrupos A, B, C, W135, X, Y, Z y 29E de N. meningitidis) o un solo serogrupo. La poblaciïn de referencia tambiïn puede incluir diversas cepas diferentes de un serogrupo concreto (tales como las cepas NG6/88, BZ198, NG3/88, 297-0, BZ147, BZ169, 528, BZ133, NGE31, NGH38, NGH15, BZ232, BZ83 y 44/76 de N. meningitidis B) . Una poblaciïn de referencia preferida consta de las 5 cepas mïs comunes de N. meningitidis y/o de las 5 cepas mïs comunes de N. gonorrhoeae.

La poblaciïn de referencia comprende preferentemente cepas k extraïdas de diferentes ramas k de un ïrbol filogenïtico adecuado, tales como los descritos en (a) Ni y col. (1992) Epidemiol Infect 109: 227-239 (b) Wolff y col. (1992) Nucleic Acids Res 20: 4657 (c) Bygraves y Maiden (1992) J. Gen. Microbiol. 138: 523-531 (d) Caugant y col.

(1987) J. Bacteriol. 69: 2781-2792. Otro ïrbol filogenïtico que puede usarse se muestra en la Figura 1 del presente documento.

Se apreciarï que, en la poblaciïn de referencia, sïlo se incluirï una especie, serogrupo o cepa concretos, si ïsta codifica la proteïna en la cual se localiza el aminoïcido en cuestiïn. En el caso de aminoïcidos incluidos en la ORF40, descrita mïs adelante, la poblaciïn de referencia no debe incluir N. gonorrhoeae porque esta especie no contiene la ORF40.

Para proteïnas solo encontradas en N. meningitidis, una poblaciïn de referencia preferida comprende:

- N. meningitidis A, cepa Z2491

- N. meningitidis B, cepa NG6/88

- N. meningitidis W, cepa A22

- N.gonorrhoeae, cepa Ng F62

Estas se describen en (a) Seiler y Col1996) Mol. Microbiol. 19 (4) :841-856 (b) Maiden y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3140-3145 (c) Virji y col. (1992) Mol. Microbiol. 6:1271-1279 (d) Dempsey y col. (1991) J. Bacteriol. 173:5476-5486.

Para proteïnas encontradas sïlo en la N.meningitidis, sin embargo, una poblaciïn de referencia preferida comprende:

- N. meningitidis A, cepa Z2491

- N. meningitidis B, cepa NG6/88

- N. meningitidis W, cepa A22

Las secuencias de aminoïcidos de diferentes Neissierias pueden compararse fïcilmente usando ordenadores. Tïpicamente esto implicarï el alineamiento de diversas secuencias usando un algoritmo tal como CLUSTAL [Thompson y col. (1994) Nucleic “Acids Res 22: 4673=4680; Trends Biochem Sci (1998) 23: 403405] o, preferentemente, PILEUP [parte del paquete informïtico GCG de Wisconsin, preferentemente la versiïn 9.0].

Los aminoïcidos conservados se aprecian fïcilmente en un alineamiento de secuencias mïltiple - en la posiciïn del aminoïcido en cuestiïn un gran parte de las secuencias alineadas contendrïn el aminoïcido en particular. Los aminoïcidos conservados pueden apreciarse mïs visualmente usando un programa tal como BOXSHADE [disponible, por ejemplo, on-line en el NIH], PRETYBOX [GCG] Wisconsin, versiïn 10] o JALVIEW [disponible on-line en el EBI].

La invenciïn tambiïn proporciona una proteïna que comprende una de las secuencias mostradas en las Figuras.

Las proteïnas de la invenciïn pueden prepararse, por supuesto, mediante diversos medios (por ejemplo, por expresiïn recombinante, expresiïn natural, purificaciïn a partir de cultivo celular, sïntesis quïmica, etc.) y en diversas formas (por ejemplo, natural, fusiones, etc.) . Preferentemente, se preparan de una forma sustancialmente pura (es decir, sustancialmente libre de otras proteïnas Neisseriales o cïlulas huïsped) .

Tambiïn se desvelan anticuerpos que se unen a estas proteïnas. ïstos pueden ser policlonales o monoclonales y pueden producirse mediante cualquier medio adecuado.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invenciïn proporciona ïcido nucleico que codifica las proteïnas de la invenciïn. Tambiïn debe apreciarse que la invenciïn proporciona ïcidos nucleicos que comprenden secuencias complementarias a ïstos (por ejemplo para fines antisentido o exploraciïn) .

Tambiïn se desvelan en la presente ïcidos nucleicos que pueden hibridarse con el ïcido nucleico de N. meningitidis desvelado en los ejemplos, preferentemente en condiciones de “alta rigurosidad” (por ejemplo 65 ïC en una soluciïn de 0, 1x SSC, SDS 0, 5%) .

El ïcido nucleico de acuerdo con la invenciïn puede prepararse, por supuesto, de diversas maneras (por ejemplo, mediante sïntesis quïmica, a partir de bibliotecas genïmicas o genotecas de ADNc, a partir del propio organismo, etc.) y pueden adoptar diversas formas (por ejemplo, monocatenario, bicatenario, vectores, sondas, etc.) .

Ademïs, la expresiïn “ïcido nucleico” incluye ADN y ARN y tambiïn sus anïlogos, tales como los que contienen estructuras modificadas y tambiïn ïcidos nucleicos peptïdicos (ANP) , etc.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invenciïn proporciona vectores que comprenden secuencias de nucleïtidos de la invenciïn (por ejemplo vectores de expresiïn) y cïlulas huïsped transformadas con ellas.

De acuerdo con un aspecto... [Seguir leyendo]

1. Una proteïna que comprende un fragmento antigïnico de la proteïna 953 neisserial MKKIIFAALAAAAVGTASATYKVDEYHANVRFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITI PVANLQSGSQPFTGHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMRGKTAPVKLKAEKFN CYQSPMAETEVCGGDFSTTIDRTKWGVDYLVNAGMTKNVRIDIQIEAAKQ; MKKIIFAALAAAAISTASAATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDIT IPIANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKF NCYQSPMEKTEVCGGDFSTTIDRTKWGMDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ; o MKKIIIAALAAAAIGTASAATYKVDEYHANARFSIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDIT IPVANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKF NCYSPMLKTEVCGGDFSTTIDRTKWGMDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ, siempre que dicha proteïna no comprenda la secuencia MKKIIFAALAAAAVGTASATYKVDEYHANVRFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIP VANLQSGSQPFTGHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMRGKTAPVKLKAEKFNCY QSPMAETEVCGGDFSTTIDRTKWGVDYLVNAGMTKNVRIDIQIEAAKQ; MKKIIFAALAAAAISTASAATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITI PIANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNC YQSPMEKTEVCGGDFSTTIDRTKWGMDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ; o MKKIIIAALAAAAIGTASAATYKVDEYHANARFSIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITI PVANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNC YSPMLKTEVCGGDFSTTIDRTKWGMDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ, y en donde el mencionado fragmento comprende una secuencia de aminoïcidos seleccionada de:

(a) ATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIP (I/V) ANLQSGS QHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPM; o

(b) KTEVCGGDFSTTIDRTKWG (M/V) DYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ.

2. Un ïcido nucleico que codifica una proteïna de acuerdo con cualquier reivindicaciïn anterior.

3. Un vector que comprende la secuencia de ïcido nucleico de la reivindicaciïn 2.

4. Una cïlula huïsped transformada con el vector de la reivindicaciïn 3.

5. Una proteïna de acuerdo con la reivindicaciïn 1, o el ïcido nucleico de acuerdo con la reivindicaciïn 2, para su uso como un medicamento.

6. El uso de una proteïna de acuerdo con la reivindicaciïn 1, o ïcido nucleico de acuerdo con la reivindicaciïn 2, en la fabricaciïn de un medicamento para tratar o prevenir la infecciïn debida a bacteria Neisserial.

7. El uso de una proteïna de acuerdo con la reivindicaciïn 1, o ïcido nucleico de acuerdo con la reivindicaciïn 2, en la fabricaciïn de un reactivo de diagnïstico multi-especïfico.