Antígeno recombinante.Péptido recombinante de la subunidad catalítica de la proteína serina/treonina fosfatasa de Angiostrongylus costaricensis y péptidos activos empleados en la elaboración de una vacuna antihelmíntica intranasal

Antígeno recombinante.

La presente invención se refiere a los ácidos nucleicos que codifican la subunidad catalítica de la proteína serina/treonina fosfatasa de Angiostrongylus costaricensis, la proteína, péptidos sintéticos, y los anticuerpos generados contra esta proteína y estos péptidos. La presente invención también se refiere a una composición que se usa como inmunógeno, generando respuesta inmune protectora frente a la infección de parásitos nemátodos.

Estado de la técnica anterior

El filum Nematoda engloba a muchos parásitos de importancia médica y veterinaria como: Ascacris lumbricoides, Trichuris trichura, Enterobius vermicularis, Necator americanus, Ancylostoma duodenale y Strongyloides stercoralis, y las filarias Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Loa-loa, Onchocerca volvulus, Mansonella entre otros los cuales constituyen un verdadero problema de salud pública ampliamente diseminado en el mundo. Numerosas especies causan grandes pérdidas económicas en ganadería, como por ejemplo: Teladorsagia circumcincta, T. trifurcata, Trichostrongylus vitrinus, T. capricola, Nematodirus filicollis, Strongyloides ramsoni, Oesophagostomum spp, Ascaris suum, entre otros.

La mayoría de nematelmintos parásitos tienen en común en su ciclo biológico su paso por la pared intestinal hacia diferentes órganos o su fijación a nivel de la mucosa intestinal, originando perdida de peso, diarreas y algunos casos hemorragias. Aunque la mortalidad es relativamente baja, la morbilidad es muy elevada.

Los antihelmínticos usados actualmente son compuestos químicos con baja eficacia, debido a la aparición cada vez mayor de nemátodos resistentes. Esta resistencia a los antihelmínticos crea la necesidad de desarrollar antiparasitarios más eficaces y específicos. Las vacunas han sido consideradas como la mejor alternativa para los antihelmínticos para el control de nematodos gastrointestinales. De cualquier modo, a pesar de que existen varios antígenos que proveen diferentes grados de protección no hay vacunas contra nematodos parásitos.

Los estudios actuales van encaminados a la búsqueda de proteínas con características inmunoprotectoras como posibles candidatas a ser usadas en vacunas.

Numerosos han sido los trabajos publicados donde se describen desde fracciones totales, antígenos excretados, antígenos purificados y o recombinantes así como diferentes adyuvantes o las formas de evaluación de la protección (Bethony et al., Vaccines against blood-feeding nematodes of humans and livestock. Parasitology. 2006: 133 S63-79; Miller & Horoho, Immunological aspects of nematode parasite control in sheep. J Anim Sci. 2006. Apr: 84 Suppl: E124-32).

Uno de los primeros estudios sobre inmunoprotección con péptidos sintéticos fue realizado por Robinson et al., (High levels of protection induced by a 40-mer synthetic peptide vaccine against the intestinal nematode parasite Trichinella spiralis. Immunology. 1995. Dec; 86(4):495-8), donde describen el empleo de un péptido de 40 aminoácidos (100 μg), vía subcutánea en combinación con el coadyuvante de Freund.

El coadyuvante usado, la vía de inoculación y la concentración de la proteína son factores importantes a tener a tener en cuenta en el desarrollo de vacunas. Entre los coadyuvantes mas utilizados en estos ensayos esta el coadyuvante de Freund, QuilA, hidróxido de aluminio, hidróxido de berilio etc. Algunos de los cuales o han demostrado ineficacia o actualmente no se recomienda su empleo.

Hasta el momento los niveles de protección encontrados son en general bajos, por ejemplo en estudios realizados con Haemonchus contortus: Yanming et al., (Vaccination of goats with recombinant galectin antigen induces partial protection against Haemonchus contortus infection. Parasite Immunol. 2007. Jun; 29(6):319-26) han empleado las proteínas rHco-gal-m and rHco-gal-f con coadyuvante de Freund en cabras, encontrando una reducción del 37% de la eliminación de huevos en heces, mientras que Reszka et al. 2007 utilizaron una aminopeptidase H11 recombinate (300 ug) vía intramuscular en ovejas obtienen una reducción del 30% de la carga parasitaria. En estudios anteriores, Redmond y Knox (Protection studies in sheep using affinity-purified and recombinant cysteine proteinases of adult Haemonchus contortus. 2004. Vaccine 22:4252-4261) obtuvieron una reducción del 38% de la carga parasitaria en ovejas usando una cysteina proteinasa. Aunque para otros nematodos se obtuvo una protección en ratas del 75% contra Brugia malayi empleando la proteína recombinante Bm-ALT-2 (Thirugnanam et al., Brugia malayi: comparison of protective immune responses induced by Bm-alt-2 DNA, recombinant Bm-ALT-2 protein and prime-boost vaccine regimens in a jird model. Exp Parasitol. 2007. Aug;116(4):483-91. Epub 2007 Mar 6) y una protección del 70% usando una pirofosfatasa inorgánica frente Ascaris suum en BALB/c (Islam, Pyrophosphatase of the roundworm Ascaris suum plays an essential role in the worm's molting and development. Infect. Immun. 2005. Apr; 73(4):1995-2004). Frente a Ancylostoma caninum han sido probadas varias proteínas como candidatas a vacunas, Fujiwara y col, (Protection against hookworm infection elicited by vaccination with recombinant Ac-16 is mediated by reduction of Word fecundity and canine host blood loss. Clin Vaccine Immunol. 2007. Mar;14(3):281-287) obtuvieron una reducción del 63% de los huevos encontrados en heces de perros inmunizados con la proteína Ac-16, Zhan et al., (Biochemical characterization and vaccine potential of a heme-binding glutathione transferase from the adult hookworm Ancylostoma caninum. Infect Immun. 2005 Oct; 73(10):6903-11) emplearon una glutathion S-transferasa en perros obteniendo una reducción del 39.4% e inmunizando con una metaloproteinasa recombinante Hotez et al. (Effect of vaccination with a recombinant fusion protein encoding an astacinlike metalloprotease (MTP-1) secreted by host-stimulated Ancylostoma caninum third-stage infective larvae. J Parasitol. 2003 Aug;89(4):853-5) obtuvieron una reducción del 32.3% de huevos en heces.

El mayor conocimiento en la relación parasito-hospedador ha permitido la identificación de antígenos considerados vitales para la supervivencia del nematodo como es el caso de las proteínas de excreción/secreción, Vercauteren et al. (Vaccination with an Ostertagia ostertagi polyprotein allergen protects calves against homologous challenge infection. Infect Immun. 2004 May; 72(5):2995-3001) utilizaron la Ostertagia polyprotein allergen (OPA) en su forma nativa y recombinante frente a Ostertagia ostertagi encontrando una reducción del 60% de huevos en heces en ganado vacuno en el grupo inoculado con la proteína nativa. Bungiro et al. (Purification and molecular cloning of and immunization with Ancylostoma ceylanicum excretory-secretory protein 2, an immunoreactive protein produced by adult hookworms. Infect Immun. 2004 Apr;72(4):2203-13) también emplearon una proteína de excreción/secreción, la AceES-2 frente a Ancylostoma ceylanicum en hámster obteniendo una reducción de la anemia al suministrar vía oral dicha proteína nativa.

Tsuji et al. (Recombinant Ascaris 16-Kilodalton protein-induced protection against Ascaris suum larval migration after intranasal vaccination in pigs. J Infect Dis. 2004 Nov 15;190(10):1812-20. Epub 2004 Sep 30), alcanzaron una protección del 58% al inocular cerdos por vía intranasal con la proteína recombinante As16 combinada con la toxina colérica.

Además de proteínas, también se han empleado genes como inmunomoduladores, Wang et al. (Vaccination of mice with DNA vaccine induces the immune response and partial protection against T. spiralis infection. Vaccine. 2006 Feb 20;24(8):1205-12. Epub 2005 Sep 19) obtuvieron una reducción significativa de larvas de Trichinella spiralis en músculo al inocular ratas con el gen TspE1, también se ha realizado este tipo de estudios frente a Onchocerca vulvolus usando el gen ALT-2 (Ramachandran et al. The larval specific lymphatic filarial ALT-2: induction of protection using protein or DNA vaccination. Microbiol Immunol. 2004;48(12):945-55) y frente a Strongyloides stercoralis usando el gen Sseat-6 que corresponde a una... [Seguir leyendo]

1. Péptido que se selecciona de la lista que consiste en:

a. péptido que consiste esencialmente en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO:1

b. fragmento de la secuencia aminoacídica SEQ ID NO:1 que consiste esencialmente en la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ó SEQ ID NO:5

c. péptido cuya secuencia aminoacidica presenta una identidad de, al menos, un 80% con la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ó SEQ ID NO:5

su uso como medicamento.

2. Péptido según la reivindicación 1, cuya secuencia aminoacídica presenta una identidad de, al menos, un 90% con la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ó SEQ ID NO:5.

3. Péptido según la reivindicación 1, cuya secuencia aminoacídica presenta una identidad de, al menos, un 95% con la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ó SEQ ID NO:5.

4. Péptido según la reivindicación 1,cuya secuencia aminoacidica presenta una identidad de, al menos, un 98% con la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ó SEQ ID NO:5.

5. Péptido según la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1.

6. Péptido que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2.

7. Péptido que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3.

8. Péptido que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:4.

9. Péptido que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:5.

10. Péptido que consiste en cualquiera de las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 ó SEQ ID NO:5, o cualquiera de sus combinaciones.

11. Péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2

12. Péptido cuya secuencia aminoacídica presenta una identidad con un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6-11, seleccionada de cualquiera de las siguientes:

a. al menos un 80%.

b. al menos un 90%.

c. al menos un 95%.

d. al menos un 98%.

13. Moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una o más secuencias de nucleótidos, que codifican a toda o a una fracción del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6-12, o cualquiera de sus combinaciones.

14. Moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una o más secuencias de nucleótidos, que codifican, o que son capaces de transcribirse, a toda o una fracción del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para su uso como medicamento.

15.Anticuerpos producidos tras la inmunización de un animal, con un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, o cualquiera de sus combinaciones.

16.Anticuerpos según la reivindicación anterior, donde el animal empleado para la inmunización es un mamífero.

17.Anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 15-16, para su uso como medicamento.

18. Composición que comprende:

a. un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-12,

b. un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, o

c. cualquiera de sus combinaciones.

19. Composición según la reivindicación 18 que además comprende excipientes farmacológicamente aceptables.

20. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 18-19, para su uso como medicamento.

21. Composición según la reivindicación 20, donde el medicamento es una vacuna.

22. Vacuna que comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, o una molécula de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 13-14.

23. Vacuna según la reivindicación 22, que además comprende un adyuvante.

24. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 22-23 que además comprende la subunidad b de la toxina colérica.

25.Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 22-24 donde cualquiera de los péptidos de las reivindicaciones 6-12, se encuentra polimerizado con la subunidad b de la toxina colérica.

26. Vacuna según la reivindicación anterior donde el péptido que se encuentra polimerizado consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

27. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 22-26 que comprende también una matriz ISCOM.

28. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 18-21, para la elaboración de un medicamento o de una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 22-27, para la prevención o tratamiento de la parasitación por nemátodos de un animal.

29. Uso de una composición que comprende:

a. uno o varios péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-12,

b. una molécula de ácido nucléico según cualquiera de las reivindicaciones 13-14, o

c. un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 15-17,

d. cualquiera de las combinaciones de a, b ó c,

en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de la parasitación por nemátodos de un animal.

30. Composición que comprende una construcción genética de DNA, la cual dirige la transcripción in vitro o intracelular de las moléculas de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 13-14, y que comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de secuencias:

a. secuencia de nucleótidos de DNA que comprende, al menos, la secuencia codificante de cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 13-14, para su transcripción in vitro, o intracelular, ó

b. secuencia de nucleótidos de DNA correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende la secuencia codificante de las secuencias según el paso a. operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirige la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar.

31. Composición según la reivindicación anterior, en la que el péptido y/o los péptidos se encuentran, o se traducen, en una cantidad terapéuticamente efectiva, capaz de generar anticuerpos para su uso en la elaboración de vacunas.