Anticuerpos neutralizantes de citomegalovirus humano y su uso.

Un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a antígeno,

que se une a citomegalovirushumano (CMVh) y neutraliza la infección con CMVh de células endoteliales, células epiteliales, células de la retina ycélulas dendríticas, y que es específico de una combinación de proteínas UL130 y UL131A de CMVh, formando lacombinación el epítopo reconocido por dicho anticuerpo o dicho fragmento de unión, en donde el anticuerpo o elfragmento:

(a) comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera que tienen las secuencias de aminoácidosde SEQ ID NOs: 7 y 8, respectivamente, de SEQ ID NOs: 17 y 18, respectivamente, de SEQ ID NOs: 39 y 40, respectivamenteo de SEQ ID NOs: 49 y 18, respectivamente;

(b) comprende secuencias de CDR1, 2 y 3 de la cadena pesada, tal como se describen en SEQ ID NOs: 1,2 y 3, respectivamente, y secuencias de CDR1, 2 y 3 de la cadena ligera, tal como se describen en SEQ ID NOs: 4,5 y 6, respectivamente;

(c) comprende secuencias de CDR1, 2 y 3 de la cadena pesada, tal como se describen en SEQ ID NOs: 11,12 y 13, respectivamente, y secuencias de CDR1, 2 y 3 de la cadena ligera, tal como se describen en SEQ ID NOs:14, 15 y 16, respectivamente; o

(d) comprende secuencias de CDR1, 2 y 3 de la cadena pesada, tal como se describen en SEQ ID NOs: 33,34 y 35, respectivamente, y secuencias de CDR1, 2 y 3 de la cadena ligera, tal como se describen en SEQ ID NOs:36, 37 y 38, respectivamente.

Anticuerpos neutralizantes de citomegalovirus humano y su uso

Campo técnico

Esta invención se refiere a anticuerpos que tienen especificidad hacia el citomegalovirus humano, a anticuerpos monoclonales adecuados que tienen esa especificidad y a linfocitos B inmortalizados que producen tales anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos se pueden utilizar en métodos de cribado, así como en el diagnóstico, profilaxis y terapia de una enfermedad.

Técnica anterior

El citomegalovirus humano (CMVh) es un agente patógeno ampliamente distribuido que puede causar una patología grave en adultos inmunodeprimidos y después de una infección del feto, y se ha implicado en enfermedades crónicas tales como la aterosclerosis. El CMVh infecta múltiples tipos de células incluyendo los fibroblastos, las células endoteliales, epiteliales y hematopoyéticas [1]. Las cepas atenuadas de CMVh propagadas in vitro, que se están desarrollando como vacunas candidatas, han perdido el tropismo hacia las células endoteliales, mientras que conservan la capacidad de infectar fibroblastos [2]. Recientemente, se ha mostrado que dos complejos de glicoproteínas víricas controlan el tropismo celular de CMVh. Para la infección de fibroblastos se requiere un complejo de gH, gL y gO, mientras que un complejo de gH, gL y proteínas codificadas por los genes UL131-UL128 son responsables de la infección de las células endoteliales, las células epiteliales y las células dendríticas [2-8].

Las globulinas hiperinmunes ya se comercializan para la profilaxis de la enfermedad por CMVh asociada con trasplante, y una evidencia reciente indica que tienen un efecto terapéutico en las mujeres embarazadas [9]. Este enfoque terapéutico está limitado por la baja cantidad de anticuerpos neutralizantes que se puede transferir y por esta razón, sería muy deseable la disponibilidad de anticuerpos humanos (tales como anticuerpos monoclonales humanos) con una capacidad de neutralización elevada. Sin embargo, aún no se ha establecido la diana de los anticuerpos neutralizantes de CMVh. Un trabajo previo identificó gB y gH como dianas potenciales. Sin embargo, un anticuerpo humanizado para gH (MSL 109) no mostró ningún efecto significativo en un ensayo clínico [10, 11]. Se ha descrito que el anticuerpo monoclonal SD MSL-109 es un anticuerpo monoclonal neutralizante de citomegalovirus [43]. Todos los anticuerpos neutralizantes descritos hasta la fecha tenían una capacidad neutralizante reducida ya que neutralizan la infección con CMVh solo a concentraciones elevadas. Por ejemplo, el anticuerpo MSL-109 solo mostraba un 50% de actividad neutralizante a una concentración de 10 μg/ml, un hecho que podría explicar la falta de un efecto in vivo [11]. La potencia neutralizante de los anticuerpos anti-CMVh se mide típicamente usando fibroblastos como células diana. Sin embargo, se sabe que el CMVh causa patología infectando otros tipos de células, tales como las células epiteliales, endoteliales y leucocitos. No parece haber ningún anticuerpo monoclonal disponible que sea capaz de neutralizar con alta potencia una infección de células diana no fibroblastos. Los anticuerpos neutralizantes descritos recientemente para UL128 y UL130 también mostraron una potencia muy baja en la neutralización de la infección de células endoteliales [7].

Por tanto, se requiere la producción de anticuerpos neutralizantes de CMVh, así como el esclarecimiento de la diana a la que se unen dichos anticuerpos.

Descripción de la invención La invención se basa en la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que neutralizan la infección con CMVh y que tienen una potencia particularmente alta para neutralizar la infección con CMVh. Tales anticuerpos son deseables, ya que solo se requieren concentraciones bajas con el fin de neutralizar una cantidad dada de virus. Esto facilita unos niveles de protección más elevados, aunque se administran menores cantidades de anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales humanos y los clones de linfocitos B inmortalizados que secretan tales anticuerpos, también se incluyen dentro del alcance de la invención.

Los inventores han descubierto que anticuerpos dirigidos a una combinación de UL130 y UL131A son particularmente eficaces en la neutralización de CMVh. La combinación puede ser un complejo de UL130 y UL131A que forma un epítopo reconocido por el anticuerpo o un anticuerpo se puede dirigir a uno de UL130 y UL131A, siendo necesaria la presencia de la otra proteína para la especificidad.

Por lo tanto, la invención proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a antígeno que se une al citomegalovirus humano (CMVh) y neutraliza la infección con CMVh de células endoteliales, células epiteliales, células de la retina y células dendríticas, y que es específico de una combinación de proteínas de CMVh, UL130 y UL131A, en donde la combinación forma el epítopo reconocido por dicho anticuerpo o fragmento de unión, en donde el anticuerpo o el fragmento (a) comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 7 y 8, respectivamente, SEQ ID NOs: 17 y 18, respectivamente, SEQ ID NOs: 39 y 40, respectivamente o SEQ ID NOs: 49 y 18, respectivamente;

(b) comprende secuencias de CDR1, 2 y 3 de la cadena pesada, tal como se describen en SEQ ID NOs: 1, 2 y 3, respectivamente, y secuencias de CDR1, 2 y 3 de la cadena ligera, tal como se describen en SEQ ID NOs: 4, 5 y 6, respectivamente;

(c) comprende secuencias de CDR1, 2 y 3 de la cadena pesada, tal como se describen en SEQ ID NOs: 11, 12 y 13, respectivamente, y secuencias de CDR1, 2 y 3 de la cadena ligera, tal como se describen en SEQ ID NOs: 14, 15 y 16, respectivamente; o

(d) comprende secuencias de CDR1, 2 y 3 de la cadena pesada, tal como se describen en SEQ ID NOs: 33, 34 y 35, respectivamente, y secuencias de CDR1, 2 y 3 de la cadena ligera, tal como se describen en SEQ ID NOs: 36, 37 y 38, respectivamente.

Anticuerpos de la invención La invención proporciona anticuerpos monoclonales o recombinantes que tienen una potencia particularmente alta para neutralizar CMVh. La invención también proporciona fragmentos de estos anticuerpos recombinantes o monoclonales, en particular fragmentos que conservan la actividad de unión al antígeno de los anticuerpos.

En esta memoria descriptiva, por "potencia elevada para neutralizar CMVh" se entiende que una molécula de anticuerpo de la invención neutraliza CMVh en un ensayo convencional a una concentración mucho menor que los anticuerpos conocidos en la técnica, por ejemplo, en comparación con MSL-109.

Preferiblemente, la molécula de anticuerpo de la presente invención puede neutralizar a una concentración de 0, 01, 0, 0075, 0, 005, 0, 004 o menor, preferiblemente a una concentración de anticuerpo de 10-8 o inferior, preferiblemente 10-9 M o inferior, preferiblemente 10-10 M o inferior, es decir, 10-11 M, 10-12 M, 10-13 M o inferior. Esto significa que solo se requieren concentraciones muy bajas de anticuerpo para neutralizar el 50% de una cepa clínica aislada de CMVh in vitro, en comparación con la concentración requerida de MSL-109 para neutralizar el mismo título de CMVh. Preferiblemente, la concentración de anticuerpo de la invención para neutralizar el 50% de la infección de células endoteliales, células epiteliales y células dendríticas con una cepa clínica aislada de CMVh, es 50 veces o más (es decir, 75, 100, 150, 200 o más) menor que la requerida con MSL-109. La potencia se puede medir empleando un ensayo de neutralización convencional, tal como se describe en la técnica.

Los anticuerpos de la invención son capaces de neutralizar CMVh. Un anticuerpo de acuerdo con la invención evita la infección de fibroblastos y de células endoteliales. Los anticuerpos de la invención también evitan la infección de células dendríticas y células epiteliales, tales como las células de la retina.

Estos anticuerpos se pueden utilizar como agentes profilácticos o terapéuticos después de una formulación apropiada, o como una herramienta de diagnóstico.

Un "anticuerpo neutralizante" es uno que puede neutralizar la capacidad de ese agente patógeno para iniciar y/o mantener una infección en un hospedador. La invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano neutralizante, en donde el anticuerpo reconoce un antígeno del citomegalovirus humano (CMVh) .

Preferiblemente, un anticuerpo de acuerdo con la invención tiene especificidad hacia una combinación UL130 y UL131A.

Preferiblemente un anticuerpo de acuerdo con la invención es un anticuerpo monoclonal denominado en este documento 1F11 o 2F4. Estos anticuerpos se aislaron inicialmente... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a antígeno, que se une a citomegalovirus humano (CMVh) y neutraliza la infección con CMVh de células endoteliales, células epiteliales, células de la retina y células dendríticas, y que es específico de una combinación de proteínas UL130 y UL131A de CMVh, formando la combinación el epítopo reconocido por dicho anticuerpo o dicho fragmento de unión, en donde el anticuerpo o el fragmento:

(a) comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 7 y 8, respectivamente, de SEQ ID NOs: 17 y 18, respectivamente, de SEQ ID NOs: 39 y 40, respectivamente o de SEQ ID NOs: 49 y 18, respectivamente;

(b) comprende secuencias de CDR1, 2 y 3 de la cadena pesada, tal como se describen en SEQ ID NOs: 1, 2 y 3, respectivamente, y secuencias de CDR1, 2 y 3 de la cadena ligera, tal como se describen en SEQ ID NOs: 4, 5 y 6, respectivamente;

(c) comprende secuencias de CDR1, 2 y 3 de la cadena pesada, tal como se describen en SEQ ID NOs: 11, 12 y 13, respectivamente, y secuencias de CDR1, 2 y 3 de la cadena ligera, tal como se describen en SEQ ID NOs: 14, 15 y 16, respectivamente; o

(d) comprende secuencias de CDR1, 2 y 3 de la cadena pesada, tal como se describen en SEQ ID NOs: 33, 34 y 35, respectivamente, y secuencias de CDR1, 2 y 3 de la cadena ligera, tal como se describen en SEQ ID NOs: 36, 37 y 38, respectivamente.

2. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo según la reivindicación 1.

3. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2, que comprende la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 9, 10, 19, 20.

2. 32.

4. 48 o 50, o una secuencia de nucleótidos que codifica la misma secuencia de aminoácidos que una cualquiera de SEQ ID NOs: 9, 10, 19, 20.

2. 32.

4. 48 o 50.

4. Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2 o 3.

5. Una célula transformada con un vector de expresión según la reivindicación 4.

6. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o el fragmento que se une a antígeno según la reivindicación 1, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. La composición según la reivindicación 6, que comprende adicionalmente un segundo anticuerpo anti-CMVh o un fragmento del mismo que se une a antígeno, que neutraliza la infección con CMVh.

8. La composición según la reivindicación 7, en donde dicho segundo anticuerpo anti-CMVh es específico de la proteína gB de CMVh.