Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un primer anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a la proteína de toxina Shiga tipo 1 (Stxl) y un segundo anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a la proteína de toxina Shiga tipo 2 (Stx2),

en donde el primer anticuerpo comprende una región constante de inmunoglobulina humana y comprende las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina, como se establecen en las SEQ ID NOs: 19 y 21 y en donde el segundo anticuerpo comprende una región constante de inmunoglobulina humana y comprende las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina, como se establecen en las SEQ ID NOs: 42 y 44

Anticuerpos monoclonales humanizados que protegen contra la enfermedad inducida por la toxina shiga.

Campo de la invención

Los solicitantes describen una familia de proteínas bacterianas de unidades múltiples que se asocian con la colitis hemorrágica y la secuela que amenaza la vida, síndrome urémico hemolítico. Estas proteínas, definidas como miembros de la "familia de toxina Shiga", se han utilizado en el aislamiento e identificación de anticuerpos monoclonales de murino. Los solicitantes describen además, la construcción de anticuerpos monoclonales humanizados que incorporan las regiones variables de ratón. Los solicitantes también describen anticuerpos para toxinas Shiga o toxoides, tanto monoclonales como policlonales, y su uso en el tratamiento, diagnóstico, y prevención de la enfermedad y de las infecciones provocadas por E. coli patogénico. Se describe la preparación de anticuerpos monoclonales humanizados para proteínas de la familia de toxina Shiga.

Antecedentes de la invención

Se asocian Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC, por sus siglas en inglés) con brotes transmitidos por alimentos con diarrea con sangre o "colitis hemorrágica" (HC, por sus siglas en inglés) y el síndrome urémico hemolítico (HUS, por sus siglas en inglés). (Spika, J. y col., J. Pediatr., 109:287-297 (1986); Remis, R. Ann. Intern. Med., 101:624-626 (1984); Riley, L. y col., N. Engl. J. Med., 308:681-685 (1983)). La infección EHEC puede ser mortal y posee una amenaza importante para los jóvenes y los ancianos, quienes son los que más probabilidad tienen de desarrollar serias complicaciones de infecciones EHEC. Diversos brotes y casos esporádicos de HC y HUS han ocurrido durante los últimos años, con el brote más grande de E.U.A. en 1993. En tal brote, más de 500 casos de HC y HUS se localizaron en hamburguesas contaminadas de una caja sorpresa de un restaurante de comida rápida. (Centers for Disease Control and Prevention, Morbid. Mortal Weekly Rep., 42:258 (1993)). En julio de 1996, un brote más grande de EHEC en Japón resultó en más de 10,000 individuos infectados y 8 muertes. Muchos niños japoneses requirieron hospitalización.

Primordialmente, HC y HUS se transmiten por la ingestión de comida contaminada, particularmente productos de carne de vacuno no totalmente cocinada, tal como hamburguesas. (Doyle y col., J. Appl. Environ. Microbiol. 53:2394 (1987); Samadpour y col., J. App. Environ. Microbiol. 60: 1038 (1994)). Con la prevalencia de EHEC en ganado y la naturaleza subjetiva de diferenciar entre hamburguesas parcial y totalmente cocinadas, una parada en un restaurante de comida rápida o una parrillada familiar puede resultar en tragedia.

HC y HUS parecen estar mediados por la toxina producida por EHEC y Shigella dysenteriae (para una revisión, ver, O'Brien and Holmes, Microbiol. Rev., 51:206-220 (1987)). Estas bacterias producen una familia de citotoxinas estrechamente relacionadas que colectivamente se llamarán "toxinas Shiga" para el propósito de esta solicitud. Las toxinas Shiga (alternativamente, "verotoxinas") tienen actividad citotóxica, y enterotóxica (Strockbine, N. y col., Infect. Immun., 53: 135-140 (1986)).

Con base en la exhibición de la reactividad no cruzada inmunológica, las toxinas Shiga se han dividido en dos grupos. (Strockbine y col., supra). Estos grupos se han designado toxina Shiga tipo 1 (Stx1, por sus siglas en inglés) y toxina Shiga tipo 2 (Stx2, por sus siglas en inglés). El grupo Stx1 contiene la toxina Stx1 de prototipo de EHEC así como la toxina Shiga de Shigella dysenteriae tipo 1. En años recientes, otros tipos de toxinas se han descubierto y considerado ser miembros del grupo Stx2. Estas son Stx2e, Stx2c, y Stx2d. (Lindgren y col., Infection and Immunology, 61:3832 (1993); Schmitt, C. y col., Infect. Immun., 59: 1065-1073 (1991); Marques, L. y col., FEMS Lett., 44: 33-38 (1987)).

Para los propósitos de esta solicitud el término "toxina Shiga" abarca toxina Shiga y cualquiera de las demás toxinas en el grupo Stx1 o Stx2 o sus variantes. La abreviatura "Stx" se referirá a la proteína de toxina por sí misma.

A pesar de este conocimiento sobre los resultados de la exposición a estas toxinas, actualmente no existe cura o vacuna conocida para HC o HUS. Los antibióticos incluso hacer que las complicaciones severas empeoren al incrementar la toxina liberada de las bacterias. De esta manera, existe una necesidad de un compuesto para prevenir o tratar las complicaciones de EHEC producidas por la toxina Shiga. Tal compuesto puede usarse para tratar pacientes infectados y disminuir los efectos sistémicos de la toxina en el SNC, sangre y riñones. Además, si la toxina puede neutralizarse, los antibióticos pueden administrarse de manera segura para exterminar las bacterias en el tracto GI. Tal compuesto también puede ser utilizado para prevenir complicaciones infecciosas, al tratar individuos que están expuestos o con alto riesgo, antes de que adquieran la infección EHEC. Tales individuos deben incluir niños en guardería o ancianos en asilos para ancianos, en los que se ha detectado un caso de diarrea EHEC. Estos individuos tienen mayor riesgo de desarrollar diversas complicaciones y la propagación de EHEC en estos ambientes no es inusual.

El conocimiento de la reactividad cruzada inmunológica de las toxinas Shiga ofrece una perspectiva tentadora para enfoques farmacológicos del tratamiento de EHEC. Actualmente, no existen agentes profilácticos o terapéuticos conocidos disponibles para esta enfermedad. En consecuencia, existe una necesidad en la técnica de proporcionar anticuerpos monoclonales que puedan enlazar a las toxinas Shiga que sean capaces de prevenir o disminuir los efectos devastadores de estas toxinas. También existe en la técnica una necesidad de datos acerca del sitio de enlace de tales anticuerpos, de manera que otros anticuerpos con capacidades similares puedan ser identificados y aislados.

Los anticuerpos monoclonales contra las toxinas tipo Shiga se han descrito en Strockbine y col., Infection and Immunity, 1985, 50: 695-7010 y en Perera, y col., J. Clinical Microbiol., 1988, 26: 2127-2131. Strockbine et al describe que el uso del anticuerpo 13C4 neutraliza la letalidad para ratones inducida con toxina tipo Shiga de E. coli H30. Strockbine y col., además muestra el uso del 13C4 para la detección de colonias bacterianas que producen altos niveles de toxinas tipo Shiga. Perera y col., describen la producción de cinco anticuerpos monoclonales de ratón (incluyendo el anticuerpo 11E10) que son capaces de neutralizar la citotoxicidad de la toxina II tipo Shiga. WO9820903, publicada el 22 de mayo de 1998 describe métodos terapéuticos para el tratamiento del síndrome urémico hemolítico, al administrar de anticuerpos monoclonales, anticuerpos monoclonales quiméricos y anticuerpos policlonales monoespecíficos específicos para toxina tipo Shiga.

Existe una necesidad relacionada en la técnica de anticuerpos monoclonales de humano/ratón humanizados y otros quiméricos. En estudios bien publicados, los pacientes a los que se han administrado anticuerpos monoclonales anti-TNF de murino (factor de necrosis del tumor) desarrollan respuestas de anticuerpo anti-murino al anticuerpo administrado. (Ver, por ejemplo, Exley A. R., y col., Lancet 335: 1275-1277 (1990)). Este tipo de respuesta inmune para el régimen de tratamiento, comúnmente referido como la respuesta HAMA (para anticuerpos anti-ratón humanos), disminuye la efectividad del tratamiento y puede incluso hacer que el tratamiento sea completamente ineficaz. Los anticuerpos monoclonales de humano/ratón humanizados o quiméricos han demostrado disminuir significativamente la respuesta HAMA e incrementar la efectividad terapéutica. (LoBuglio et art., P.N.A.S. 86: 4220-4224 (Junio de 1989)). Los métodos para los anticuerpos humanizados comprenden el intercambio de regiones constantes (ver por ejemplo Lobuglio et al, supra) o injerto CDR (EP0239400).

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un primer anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a la proteína de toxina Shiga tipo 1 (Stx1) y un segundo anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a la proteína de toxina Shiga tipo 2 (Stx2), en la que el primer anticuerpo comprende una región constante de inmunoglobulina humana y las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina, como se establecen en las SEQ ID NOs: 19 y 21 y en la que el segundo anticuerpo comprende una región constante de inmunoglobulina...

1. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un primer anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a la proteína de toxina Shiga tipo 1 (Stxl) y un segundo anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a la proteína de toxina Shiga tipo 2 (Stx2), en donde el primer anticuerpo comprende una región constante de inmunoglobulina humana y comprende las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina, como se establecen en las SEQ ID NOs: 19 y 21 y en donde el segundo anticuerpo comprende una región constante de inmunoglobulina humana y comprende las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina, como se establecen en las SEQ ID NOs: 42 y 44.

2. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un primer anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a Stx1 y un segundo anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza al antígeno Stx2, en donde la región variable del segundo anticuerpo comprende la región variable del anticuerpo 11E10 de murino con No. de Acceso al ATCC CRL 1907 y la región variable del primer anticuerpo comprende la región variable del anticuerpo 13C4 de murino con No. de Acceso al ATCC CKL 1794.

3. La composición farmacéutica según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el primero o segundo anticuerpo comprenden una región constante humana seleccionada del grupo que consiste de IgG, IgA, e IgM.

4. La composición farmacéutica según la reivindicación 3, caracterizada porque la región constante humana del primero o segundo anticuerpo monoclonal es IgG.

5. La composición farmacéutica según la reivindicación 3, caracterizada porque la región constante humana del primero o segundo anticuerpo monoclonal es IgG1-kappa.

6. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizada porque además comprende un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

7. El uso de una composición que comprende un primer anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a la proteína Stxl y un segundo anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a la proteína Stx2, en donde el primer anticuerpo comprende una región constante de inmunoglobulina humana y comprende las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina, como se establecen en las SEQ ID NOs: 19 y 21 y en donde el segundo anticuerpo comprende una región constante de inmunoglobulina humana y comprende las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina, como se establecen en las SEQ ID NOs: 42 y 44 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección que resulta en síndrome de uremia hemolítico provocado por Escherichia coli enterohemorrágica u otras bacterias que producen la toxina Shiga.

8. El uso de una composición que comprende un primer anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a Stx1 y un segundo anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza al antígeno Stx2, en donde la región variable del segundo anticuerpo comprende la región variable del anticuerpo 11E10 de murino con el No. de Acceso al ATCC CRL 1907 y la región variable del primer anticuerpo comprende la región variable del anticuerpo 13C4 de murino con el No. de Acceso al ATCC CKL 1794 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección que resulta en síndrome de uremia hemolítico provocado por Escherichia coli enterohemorrágica u otras bacterias que producen la toxina Shiga.

9. El uso según la reivindicación 7 u 8, en donde el primero o segundo anticuerpo comprende una región constante humana seleccionada del grupo que consiste de IgG, IgA, e IgM.

10. El uso según la reivindicación 9, en donde la región constante humana del primero o segundo anticuerpo monoclonal es IgG, preferiblemente IgG1-kappa.

11. Una composición caracterizada porque comprende un primer anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a la proteína Stx1 y un segundo anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a la proteína Stx2, en donde el primer anticuerpo comprende una región constante de inmunoglobulina humana y comprende las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina, como se establecen en las SEQ ID NOs: 19 y 21 y en donde el segundo anticuerpo comprende una región constante de inmunoglobulina humana y comprende las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina, como se establecen en las SEQ ID NOs: 42 y 44 para el tratamiento o prevención de una infección que resulta en síndrome de uremia hemolítico provocado por Escherichia coli enterohemorrágica u otras bacterias que producen la toxina Shiga.

12. Una composición caracterizada porque comprende un primer anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza a Stx1 y un segundo anticuerpo monoclonal humanizado que enlaza al antígeno Stx2, en donde la región variable del segundo anticuerpo comprende la región variable del anticuerpo 11E10 de murino con No. de Acceso al ATCC CRL 1907 y la región variable del primer anticuerpo comprende la región variable del anticuerpo 13C4 de murino con No. de Acceso al ATCC CKL 1794, para tratar o prevenir una infección que resulta en síndrome de uremia hemolítico provocado por Escherichia coli enterohemorrágica u otras bacterias que producen la toxina Shiga.

13. La composición farmacéutica según la reivindicación 11 ó 12, caracterizada porque el primero o segundo anticuerpo comprende una región constante humana seleccionada del grupo que consiste de IgG, IgA, e IgM.

14. La composición farmacéutica según la reivindicación 13, caracterizada porque la región constante humana del primero o segundo anticuerpo monoclonal es IgG, preferiblemente IgGI-kappa.