Anticuerpos monoclonales para la determinación inmunológica selectiva de formas de lamininas de alto peso molecular en líquidos corporales.

Procedimiento para la preparación de un anticuerpo monoclonal con especificidad por proteínas de la familia de las lamininas y el fragmento de laminina P1 el cual se puede preparar a partir de placenta humana por digestión con pepsina

, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se une al fragmento de laminina P1 y a laminina nativa, intacta, con aproximadamente la misma afinidad, estando excluido un anticuerpo que es producido por la línea celular de hibridoma DSM ACC2181, DSM ACC2180 o DSM ACC2182, caracterizado porque

a) animales vertebrados, no humanos, se inmunizan con el fragmento de laminina P1, el cual se puede preparar a partir de placenta humana por digestión con pepsina,

b) se obtienen linfocitos de los animales vertebrados inmunizados y se fusionan con células de mieloma,

c) se seleccionan los híbridos en cuanto a la presencia del anticuerpo con las propiedades citadas y se clonan, y d) a partir de estos clones se obtiene el anticuerpo,

en el que el anticuerpo une las estructuras plegadas nativas de los dominios de laminina P1 de la laminina y en el que el procedimiento se caracteriza porque el anticuerpo se forma por un hibridoma que resulta por fusión de células de una línea celular de mieloma y linfocitos de un animal vertebrado no humano inmunizado con fragmento de laminina P1 de placenta humana y a continuación se selecciona y porque el anticuerpo formado muestra una propiedad de unión a laminina humana purificada y a la forma de elevado peso molecular de la laminina obtenida a partir de suero humano.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E08075098.

Solicitante: SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: BRUNINGSTRASSE 50 65929 FRANKFURT AM MAIN ALEMANIA.

Inventor/es: GERL, MARTIN, STEINERT, CORNELIA, QUINT,MANFRED,DR.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/10 (Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/09 (Tecnología del ADN recombinante)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/53 (Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/18 (contra materiales animales o humanos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/08 (Anticuerpos monoclonales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > C07K16/00 (Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/20 (siendo uno de los integrantes de la fusión un linfocito B)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/02 (Preparación de células híbridas por fusión de dos o más células, p. ej. fusión de protoplastos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C... > Microorganismos > C12R1/91 (Líneas celulares)

PDF original: ES-2459290_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Anticuerpos monoclonales para la determinacion inmunologica selectiva de formas de lamininas de alto peso molecular en liquidos corporales. La presente invencion se refiere a un procedimiento para la preparacion de lineas de celulas de hibridoma y a un procedimiento para la preparacion de anticuerpos monoclonales para la determinacion inmunologica selectiva de formas de lamininas de alto peso molecular en liquidos corporales, asi como a un procedimiento para la determinacion inmunologica de laminina. La laminina es una proteina de multiples dominios que se encuentra en todas las membranas basales y que forma complejos con otros componentes distintos, tipicos de la membrana basal tales como, por ejemplo, nidogeno, proteoglicano de heparan sulfato o colageno IV (Timpl, R. (1989) Eur. J. Biochem. 180; 487 a 502) . Esta compuesta por tres polipeptidos distintos, unidos por puentes disulfuro. En este caso se forma la estructura de una cruz asimetrica (Figuras 1a y 1b) . Recientemente se identificaron muchas variantes estructurales, las cuales se forman por el ensamblaje de 8 subunidades diferentes (conocidas hasta el momento) . Para obtener una isoforma de laminina siempre se tienen que reunir polipeptidos de tres clases diferentes de moleculas: una cadena a (anteriormente cadena A) , una cadena º (anteriormente cadena B1) y una cadena y (anteriormente cadena B2) (Burgeson, R.E.; et al. (1994) Matrix Biology, vol. 14, 209 a 211) . A las lamininas se les atribuye un gran numero de funciones biologicas interesantes tales como, por ejemplo, la influencia sobre el crecimiento celular, la extension celular y el crecimiento de las neuritas, asi como la induccion de procesos de diferenciacion (Timpl, R. (1989) Eur. J. Biochem. 180; 487 a 502) . Aun cuando las lamininas son componentes tipicos de todas las membranas basales, las distintas isoformas se caracterizan por una distribucion tisular muy especifica. La merosina, por ejemplo, (= laminina 2; a2, º1, y1) es parte componente de las membranas basales de las celulas de Schwann, de los musculos estriados y de los trofoblastos (Leivo, I.; Engvall, E. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 1544 a 1548) . Otra variante, la laminina s (= laminina 3; a1, º2, y1) se encuentra en la membrana basal de las sinapsis en las placas terminales neuromusculares, en el endotelio de los vasos sanguineos y en los podocitos glomerulares (Hunter, D.D.; Shah, V.; Merlie, J.P.; Sanes, J.R. (1989) Nature 338; 229 a 234) . Un tercer ejemplo, la laminina K (= laminina 6; a3, º1/º2, y1) es especifica de las membranas basales de la piel (Marinkovich, M.P.; Lunstrom, G.P.; Burgeson, R.E. (1992a) J. Biol. Chem. 267; 17900 a 17906) . Alli, como componente de los "filamentos de anclaje", se encuentra tambien la kalinina/niceina (= laminina 5, a3, º3, y2) tipica de los tejidos epiteliales (Marinkovich, M.P.; Lunstrom, G.P.; Keene, D.R., Burgeson, R.E. (1992b) J. Cell. Biol. 119; 695 a 703) . Para la deteccion de laminina en suero humano fueron desarrollados metodos de determinacion especificos para la diagnosis de diversas enfermedades. Como posibles indicaciones se citan fibrosis/cirrosis hepatica, fibrosis hepatica alcoholica, complicaciones diabeticas de la membrana basal (BM) , enfermedades renales, arteriosclerosis inflamatoria cronica/poliartritis cronica y enfermedades tumorales (Kropf. J.; et al. (1991) Clin Chem. 37; 30; Niemela, O.; Risteli, L.; Sotaniemi, E.A.; Ristelli, J. (1985) Eur. J. Clin. Invest. 15; 132 a 137. Katayama, M.; Kamihagi, K.; Hirai, S.; Murakami, K.; Hino, F.; Kate, I. (1992) Br. J. Cancer 65; 509 a 514. Brocks, D.G.; Strecker, H.; Neubauer, H.P.; Timpl, R. (1986) Clin. Chem. 32; 787 a 791. Horikoshi, S.; Koide, H. (1991) Clin. Chim. Acta 196; 185 a 192) . Actualmente se pueden adquirir comercialmente tres metodos para la determinacion de lamininas: Procedimiento 1: Un metodo de determinacion de laminina P1 sobre la base de un antisuero policlonal se comercializa por Behringwerke AG bajo la marca registrada "RIA-gnost®" (Brocks, D.G.; Strecker, H.; Neubauer, H.P.; Timpl, R. (1986) Clin. Chem. 32; 787 a 791) . Procedimiento 2: Un inmunoensayo EIA para laminina sobre la base de dos anticuerpos monoclonales (TAKARA, Shuzo Co., LTD; Katayama et al., 1992; Katayama, M.; Kamihagi, K.; Hirai, S.; Murakami, K.; Hino, F.; Kate, I. (1992) Br. J. Cancer 65; 509 a 514) . Procedimiento 3: Un inmunoensayo enzimatico de una etapa, tipo sandwich, basado en dos anticuerpos monoclonales (Fuji Chemical Ltd.; Iwata, K. (1990) Clin. Chim. Acta 191; 211 a 220) . Mientras que en los procedimientos 1 y 3 se utilizan anticuerpos contra el fragmento "Lam P1" resistente a la pepsina, el procedimiento 2 se basa en anticuerpos contra una "laminina nativa", aislada segun el metodo de Wewer et al. (digestion cuidadosa con pepsina en ausencia de EDTA; Wewer, U.; Albrechtsen, R.; Manthorpe, M.; Varon, S.; Engvall, E.; Rouslahti, E. (1983) J. Biol. Chem. 258; 12654 a 12660) . A partir del trabajo de Katayama (procedimiento 2) se desprende que el inmunoensayo de TAKARA correlaciona relativamente bien con el RIA-gnost® (Behringwerke) (r = 0, 68) aunque en un suero tumoral (pulmonar) se presenta una distribucion de antigeno que se desvia del RIA-gnost®. A saber, segun una cromatografia de filtracion en gel de los anticuerpos dirigidos contra la "laminina nativa" en suero se detectan dos picos de antigeno en la zona de pesos moleculares de 330 a 150 kDa. En virtud de su tamafo, se debe tratar aqui de productos de degradacion de la "laminina serica". El RIA-gnost® (procedimiento 1) diagnostica por el contrario dos picos en el intervalo de 100 a 900 kDa, es decir evidentemente tanto estructuras nativas (intactas) como tambien estructuras degradadas. El reconocimiento comun de estructuras de laminina intactas y degradadas conduce, sin embargo, a inexactitudes en el dictamen diagnostico, puesto que por un lado se pueden solapar el colectivo normal y el colectivo de pacientes y, por otro lado, las fluctuaciones de concentracion en un pico se pueden equilibrar por desplazamientos cuantitativos de signo contrario en el otro pico. Para el inmunoensayo de Fuji (procedimiento 3) no existe cromatografia alguna de un suero. Pero a partir de una electroforesis en gel de SDS y de un borron de inmunotransferencia se observa que los anticuerpos utilizados reconocen en suero normal y en "suero de cirrosis hepatica" una banda de 200 kDa, es decir que evidentemente reaccionan de manera especifica con fragmentos degradados de la laminina.

Iwata, K. describe un inmunoensayo enzimatico de tipo sandwich de una sola etapa para laminina humana utilizando anticuerpos monoclonales (Iwata, K. Clinica Chimica Acta. 191 (1990) , 211-220) . Anticuerpos monoclonales contra la laminina se describen tambien por Abrahamson D.R. et al. (1989) (Abrahamson D.R. et al. J. Cell Biology (1989) , 109, 3477-3491) . Katayama et al. (1992) describen, ademas, fragmentos de laminina como marcadores tumorales (Katayama, M. et al. Br. J. Cancer (1992) , 62, 509-514) .

Frente a esto, es objeto de la presente invencion poner a disposicion un procedimiento para la preparacion de anticuerpos monoclonales que se unan al fragmento P1 de la laminina y a laminina nativa, intacta, con aproximadamente la misma afinidad.

La presente invencion se fundamenta, ademas, en la mision de poner a disposicion un procedimiento para la determinacion inmunologica de laminina nativa en base a los anticuerpos que se han de desarrollar. De este modo, en una determinacion correspondiente, se eliminan las inexactitudes en el dictamen diagnostico, como las que se tuvieron que soportar con los metodos de determinacion conocidos hasta el momento.

El problema se soluciona conforme a la invencion mediante los procedimientos definidos en las reivindicaciones.

Una linea celular de hibridoma de acuerdo con las reivindicaciones se caracteriza preferentemente porque los linfocitos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento para la preparacion de un anticuerpo monoclonal con especificidad por proteinas de la familia de las lamininas y el fragmento de laminina P1 el cual se puede preparar a partir de placenta humana por digestion con pepsina, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se une al fragmento de laminina P1 y a laminina nativa, intacta, con aproximadamente la misma afinidad, estando excluido un anticuerpo que es producido por la linea celular de hibridoma DSM ACC2181, DSM ACC2180 o DSM ACC2182, caracterizado porque a) animales vertebrados, no humanos, se inmunizan con el fragmento de laminina P1, el cual se puede preparar a partir de placenta humana por digestion con pepsina,

b) se obtienen linfocitos de los animales vertebrados inmunizados y se fusionan con celulas de mieloma,

c) se seleccionan los hibridos en cuanto a la presencia del anticuerpo con las propiedades citadas y se clonan,

y d) a partir de estos clones se obtiene el anticuerpo, en el que el anticuerpo une las estructuras plegadas nativas de los dominios de laminina P1 de la laminina y en el que el procedimiento se caracteriza porque el anticuerpo se forma por un hibridoma que resulta por fusion de celulas de una linea celular de mieloma y linfocitos de un animal vertebrado no humano inmunizado con fragmento de laminina P1 de placenta humana y a continuacion se selecciona y porque el anticuerpo formado muestra una propiedad de union a laminina humana purificada y a la forma de elevado peso molecular de la laminina obtenida a partir de suero humano.

2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo monoclonal se caracteriza por la capacidad de unirse, a pares, con otro anticuerpo conforme a la reivindicacion 1.

3. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se le clasifica en la subclase lgG 2a.

4. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se le clasifica en la subclase lgG 1.

5. Procedimiento para la preparacion de una linea celular de hibridoma, la cual produce un anticuerpo conforme a la definicion en una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque a) se fusionan celulas de una linea celular de mieloma y linfocitos de un animal vertebrado, no humano, inmunizado previamente con laminina P1 y b) se seleccionan hibridos despues de que el anticuerpo producido por el hibrido presente una buena propiedad de union a la laminina de placenta humana purificada y a la forma de elevado peso molecular de la laminina obtenida a partir de suero humano.

6. Procedimiento segun la reivindicacion 5, caracterizado porque los linfocitos se extraen de ratones de la cepa Balb/c inmunizados con laminina P1, y la linea celular de mieloma es la linea celular P3X63AG8.653 del mieloma de raton.

7. Procedimiento para la determinacion inmunologica de laminina nativa utilizando un anticuerpo estratificado fijado de forma adhesiva o covalente a un material de soporte y un segundo anticuerpo marcado, el cual reconoce el antigeno unido al anticuerpo estratificado, caracterizado porque el anticuerpo estratificado es una anticuerpo monoclonal conforme a la definicion de una de las reivindicaciones 1 a 4.

8. Procedimiento para la determinacion inmunologica de laminina nativa utilizando un anticuerpo estratificado fijado de forma adhesiva o covalente a un material de soporte y un segundo anticuerpo marcado, el cual reconoce el antigeno unido al anticuerpo estratificado, caracterizado porque el segundo anticuerpo marcado es un anticuerpo monoclonal conforme a la definicion de una de las reivindicaciones 1 a 4.