Anticuerpos monoclonales contra la claudina-18 para el tratamiento del cáncer.

Anticuerpo monoclonal que presenta la capacidad de unirse a la claudina 18A2 (CLD18A2) y que puedeobtenerse mediante un método que comprende la etapa de inmunizar un animal con un péptido que presenta lasecuencia de aminoácidos SEC ID nº 16 o un ácido nucleico o una célula huésped que expresa dicho péptido,

en el que el anticuerpo presenta la capacidad de mediar en la eliminación de células tumorales que expresanCLD18A2 in vivo, siendo inducida dicha eliminación por la unión de dicho anticuerpo a CLD18A2 expresada pordichas células, y

en el que el anticuerpo media en la eliminación de células que expresan CLD18A2 mediante la inducción de lisismediada por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y/o lisis mediada por citotoxicidad celulardependiente de anticuerpos (ADCC).

Anticuerpos monoclonales contra la claudina-18 para el tratamiento del cáncer.

Las terapias basadas en anticuerpos para el cáncer presentan el potencial de una mayor especificidad y un perfil de efectos secundarios más bajo que los fármacos convencionales. El motivo es la diferenciación precisa entre células normales y neoplásicas realizada por los anticuerpos y que su modo de acción se basa en mecanismos antitumorales inmunológicos menos tóxicos, tales como la activación del complemento y el reclutamiento de células inmunológicas citotóxicas.

Las dianas para las terapias basadas en anticuerpos deben presentar cualidades particulares, que forman la base para una discriminación correcta entre células normales y neoplásicas. Evidentemente una diana con restricción exclusiva a las células tumorales y totalmente indetectable en los tejidos normales resulta ideal para el desarrollo de terapéuticas de anticuerpos eficientes y seguras. En otro aspecto, un nivel elevado de sobreexpresión puede ser la base para la ventana terapéutica y los bajos efectos secundarios ejemplificados por el receptor de tipo 2 del factor de crecimiento epidérmico (HER-2) , que como resultado de la amplificación génica es una buena diana para el anticuerpo trastuzumab (Herceptin) .

Otras dianas para anticuerpos que ya han sido aprobados o que se encuentran en desarrollo clínico para la terapia tumoral presentan claras cualidades que no se basan en una sobreexpresión numérica de las moléculas diana sobre las células tumorales. En el caso de los anticuerpos contra el proteoglicano MUC-1, un péptido epítopo repetitivo en el esqueleto de la diana se encuentra infraglucosilado en las células tumorales y, de esta manera, alterado respecto a su contrapartida normal. En el caso de los anticuerpos contra CD20 (rituximab) , CD52 (Campath-1H) y CD22 (epratuzumab) , las dianas de anticuerpo presentan niveles de expresión comparables sobre las células tumorales y los linfocitos normales. En este caso, la ablación de células normales por el anticuerpo resulta tolerable, ya que las células madre no diana restituye el repertorio de linfocitos normal. Otros ejemplos de diferente accesibilidad de dianas para el anticuerpo son el antígeno carcinoembrionario (CEA) y la carboanhidrasa IX (CA9) . Ambos antígenos se expresan sobre epitelios normales de colon y riñón, respectivamente. Sin embargo, los anticuerpos marcados radioactivamente para la obtención de imágenes sí distinguen bien entre tumor y tejido normal, y los anticuerpos citotóxicos resultan bien tolerados. Esto con toda probabilidad se debe a una expresión restringida de CA9 y CEA sobre la cara luminal del tejido epitelial normal, a la que no pueden acceder los anticuerpos IgG. Además, la molécula antigénica de adhesión a células epiteliales (Ep-CAM) pertenece a esta categoría. Debido a que es una molécula de adhesión a células homotípicas para las células epiteliales se localiza en el espacio intercelular. Curiosamente, mientras que los anticuerpos anti-Ep-CAM de alta afinidad son muy tóxicos, los anticuerpos de afinidad intermedia resultan bien tolerados. Esto sugiere accesibilidad de la diana Ep-CAM sobre las células normales, aunque también indica que la cinética de unión de los anticuerpos podría abrir una ventana terapéutica.

Una posibilidad es que otras proteínas específicas de las células epiteliales que participan en la adhesión célula/célula también resulten atractivas para los enfoques basados en anticuerpos, ya que en epitelios bien estructurados podrían resultar escasamente accesibles a los anticuerpos pero pasar a estar expuestos sobre las células tumorales. Por lo tanto, los presentes solicitantes analizaron proteínas que participan en la organización de la estructura del tejido epitelial para su idoneidad como dianas para anticuerpos terapéuticos. Una proteína que atrajo particularmente su atención fue la claudina-18.

Los documentos WO nº 2004/047863 y nº 2005/113587 dan a conocer la identificación de las variantes de procesamiento claudina-18A1 y claudina-18A2 como dianas diagnósticas y terapéuticas del cáncer.

La molécula de la claudina-18 (CLD18) (número de acceso de Genbank: variante de procesamiento 1 (CLD18A1) : NP_057453, NM_016369 y la variante de procesamiento 2 (CLD18A2) : NM_001002026, NP_001002026) es una proteína transmembranal integral con un peso molecular de aproximadamente 27, 9/27, 72 kD. Las claudinas son proteínas de membrana integrales situadas dentro de las uniones estrechas de epitelios y endotelios. Las uniones estrechas organizan una red de filamentos interconectados de partículas intramembranosas entre células contiguas. En las uniones estrechas, la ocludina y las claudinas son los componentes de proteína transmembranal más importantes. Debido a sus fuertes propiedades de adhesión intercelular, crean una barrera primaria para impedir y controlar el transporte paracelular de solutos y restringir la difusión lateral de los lípidos y proteínas membranales, manteniendo la polaridad celular. Las proteínas formadoras de unión estrecha son participantes cruciales en la organización de la estructura del tejido epitelial. Se planteó que dichas proteínas podrían ser escasamente accesibles a los anticuerpos en epitelios bien estructurados pero pasar a encontrarse expuestas sobre las células tumorales.

La CLD18 es una tetraspanina y presenta, de esta manera, 4 regiones hidrófobas. Los presentes solicitantes obtuvieron resultados que indicaban que CLD18 muestra varias conformaciones diferentes que podrían ser dianas selectivas de los anticuerpos. Una conformación (CLD18-Conformación-1) implica que la totalidad de las cuatro regiones hidrófobas actúa de dominios transmembranales (DT) normales y que se forman dos bucles extracelulares (el bucle1, abrazado por la región hidrófoba 1, y la región hidrófoba 2 y el bucle2, abrazados por las regiones hidrófobas 3 y 4) , tal como se describe para la amplia mayoría de miembros de la familia de las claudinas. Una segunda conformación (CLD18-Conformación-2) implica que, tal como se ha descrito para PMP22, otro miembro de la familia de las tetraspaninas (Taylor et al., J. Neurosc. Res. 62:15-27, 2000) , el segundo y tercer dominios hidrofóbicos no cruzan por completo la membrana plasmática de manera que la porción (bucleD3) entre el primer y cuarto dominios transmembranales es extracelular. Una tercera conformación (CLD18-Conformación-3) implica un dominio extracelular de gran tamaño con dos regiones hidrófobas internas abrazadas por la primera y cuarta regiones hidrófobas, que sirven de dominios transmembranales normales. Debido a la presencia del sitio clásico de N-glucosilación en el bucleD3, las variantes topológicas de la claudina-18, CLD18-topología-2 y CLD18-topología-3 alojan un sitio de N-glucosilación extracelular adicional.

Se añade otro nivel de complejidad a la molécula de CLD18 por la presencia de dos variantes de procesamiento diferentes, las cuales han sido descritas en el ratón y el ser humano (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21:7380-90, 2001) . Las variantes de procesamiento CLD18A1 y CLD18A2 difieren en los primeros 21 aminoácidos N-terminales, que comprenden el primer TM y el bucle1, mientras que la secuencia proteica primaria del extremo C-terminal es idéntica.

CLD18A1 se expresa selectivamente sobre los epitelios pulmonar y estomacal normales, mientras que CLD18A2 se expresa únicamente sobre las células gástricas (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21:7380-90, 2001) . Más importante, CLD18A2 se restringe a células diferenciadas efímeras del epitelio estomacal pero no se encuentra presente en la región de células madre gástricas. Mediante la utilización de RT-PCR sensible, se ha demostrado que ambas variantes no son detectables en absoluto en ningún otro órgano humano normal, pero se expresan robustamente en varios tipos de cáncer, entre ellos los tumores de estómago, esofágico, pancreático y pulmonar, así como en líneas celulares de cáncer humanas. La expresión es más importante en los subtipos de adenocarcinoma de estas indicaciones.

En algunos cánceres el peso molecular de la proteína difiere en el cáncer y el tejido normal contiguo. La proteína de peso molecular más alto observada en el tejido sano puede pasar a presentar el mismo peso molecular observado en el cáncer tras el tratamiento de lisados del tejido con el compuesto desglucosilante PNGasa F. Esto sugiere que CLD18 se encuentra menos N-glucosilado en el cáncer que en su contrapartida de tejido normal. Esta diferencia estructural probablemente da lugar a un epítopo alterado. Un motivo clásico de N-glucosilación se encuentra en la posición aa 116 dentro del dominio bucleD3 de la molécula.

Los términos "CLD18" y "variante... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo monoclonal que presenta la capacidad de unirse a la claudina 18A2 (CLD18A2) y que puede obtenerse mediante un método que comprende la etapa de inmunizar un animal con un péptido que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 16 o un ácido nucleico o una célula huésped que expresa dicho péptido,

en el que el anticuerpo presenta la capacidad de mediar en la eliminación de células tumorales que expresan CLD18A2 in vivo, siendo inducida dicha eliminación por la unión de dicho anticuerpo a CLD18A2 expresada por dichas células, y

en el que el anticuerpo media en la eliminación de células que expresan CLD18A2 mediante la inducción de lisis mediada por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y/o lisis mediada por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) .

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, que se une a CLD18A1 y a CLD18A2.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1, que se une a CLD18A2 pero no a CDL18A1.

4. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichas células que expresan CLD18A2 son células cancerosas.

5. Anticuerpo según la reivindicación 4, en el que las células cancerosas se seleccionan de entre el grupo que consiste de células de cáncer gástrico, esofágico, pancreático y pulmonar tumorígenas.

6. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha lisis mediada por ADCC tiene lugar en presencia de células efectoras seleccionadas de entre el grupo que consiste en monocitos, células mononucleares, células NK y PMN.

7. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es un anticuerpo quimérico o humanizado, o un fragmento de un anticuerpo.

8. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, seleccionado de entre el grupo que consiste en un anticuerpo IgG1, IgG2, preferentemente IgG2a e IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgA secretora, IgD e IgE.

9. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que CLD18A2 presenta la secuencia de aminoácidos según la SEC ID nº 2.

10. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en el que CLD18A1 presenta la secuencia de aminoácidos según la SEC ID nº 8.

11. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que se une a epítopos nativos de CLD18A2 presentes sobre la superficie de células vivas.

12. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que es específico para las células cancerosas, preferentemente las células de cáncer de estómago.

13. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha CLD18A2 se expresa sobre la superficie de dichas células.

14. Anticuerpo producido por un clon depositado bajo los números de acceso DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809, o DSM ACC2810.

15. Anticuerpo que es una forma quimerizada o humanizada del anticuerpo según la reivindicación 14.

16. Hibridoma que puede producir el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

17. Hibridoma depositado bajo los números de acceso DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 ó DSM ACC2810.

18. Conjugado que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 acoplado a un agente terapéutico.

19. Conjugado según la reivindicación 18, en el que el agente terapéutico es una toxina, un isótopo radioactivo, un fármaco o un agente citotóxico.

20. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, y/o conjugado según la reivindicación 18 o 19, y portador farmacéuticamente aceptable.

21. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, conjugado según la reivindicación 18 o 19, o composición farmacéutica según la reivindicación 20, para la utilización en el tratamiento o la prevención del cáncer que implica células cancerosas que expresan CLD18A2, en las que dicho anticuerpo, dicho conjugado o dicha composición farmacéutica debe administrarse en un sujeto.

22. Anticuerpo, conjugado o composición farmacéutica según la reivindicación 21, en el que el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer pulmonar, cáncer ovárico, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de la vesícula biliar.

23. Anticuerpo, conjugado o composición farmacéutica según la reivindicación 21 o 22, en el que dicha CLD18A2 se 15 expresa sobre la superficie de dichas células.