Anticuerpos humanos de alta afinidad para el factor de crecimiento nervioso humano.

Un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente con el factor de crecimiento nervioso humano (NGF) con una KD de 1 pM o menos,

medida por resonancia de plasmón superficial, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende

(a) una región determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (HCDR3) y una CDR3 de cadena ligera (LCDR3), donde la HCDR3 y LCDR3 comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en SEC ID Nº: 90 y 98, respectivamente, y

(b) una HCDR1, HCDR2, LCDR1 y LCDR2, donde la HCDR1 es SEC ID Nº: 86, HCDR2 es SEC ID Nº: 88, LCDR1 es SEC ID Nº: 94 y LCDR2 es SEC ID Nº: 96.

Anticuerpos humanos de alta afinidad para el factor de crecimiento nervioso humano

Campo de la invención La presente invención se refiere a anticuerpos humanos y a fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos humanos que se unen específicamente con el factor de crecimiento nervioso humano (NGF) , y a métodos terapéuticos para usar esos anticuerpos.

Declaración de técnica relacionada El factor de crecimiento nervioso (NGF) fue la primera neurotrofina identificada, y su papel en el desarrollo y supervivencia de neuronas tanto periféricas como centrales se ha caracterizado bien. Se ha mostrado que el NGF es un factor de supervivencia y mantenimiento crítico en el desarrollo de neuronas sensoriales embrionarias y simpáticas periféricas y de neuronas colinérgicas del prosencéfalo basal (Smeyne et al. (1994) Nature 368: 246-249; Crowley et al. (1994) Cell 76: 1001-1011) . El NGF regula positivamente la expresión de neuropéptidos en neuronas sensoriales (Lindsay et al. (1989) Nature 337: 362-364) y su actividad está mediada mediante dos receptores unidos a membrana diferentes, el receptor TrkA y el receptor de neurotrofina común p75.

El NGF está elevado en líquido sinovial en pacientes que padecen artritis reumatoide y otros tipos de artritis. Se ha mostrado que los antagonistas de NGF previenen la hiperalgesia y alodinia en modelos animales de dolor inflamatorio neuropático y crónico.

Se describen anticuerpos anti-NGF, por ejemplo, en los documentos WO 01/78698, WO 02/096458, WO 2004/032870, Publicaciones de Patente de Estados Unidos 2005/0074821, 2004/0237124 y 2004/0219144.

Breve sumario de la invención La invención se refiere a anticuerpos completamente humanos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente con el factor de crecimiento nervioso humano (NGF) con una KD de 1 pM o menos y no reaccionan de forma cruzada con neurotrofina-3 (NT-3) . Estos anticuerpos se caracterizan por unirse con NGF con alta afinidad, alta especificidad y por la capacidad de neutralizar la actividad de NGF. En realizaciones preferidas, el anticuerpo o fragmento del mismo se une con NGF humano aproximadamente 2-10 veces más que NGF de rata y/o NGF de ratón.

Los anticuerpos pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender solamente una parte de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F (ab’) 2 o scFv) , y pueden modificarse para efectuar funcionalidad, por ejemplo, para eliminar funciones efectoras residuales (Glu que elimina funciones efectoras residuales (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164: 1925-1933) .

La invención proporciona por lo tanto un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente con el factor de crecimiento nervioso humano (NGF) con una KD de 1 pM o menos, medida por resonancia de plasmón superficial, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende (a) una región 45 determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (HCDR3) y una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) , comprendiendo la HCDR3 y LCDR3 las secuencias de aminoácidos expuestas en SEC ID Nº : 90 y 98, respectivamente, y (b) una HCDR1, HCDR2, LCDR1 y LCDR2, donde la HCDR1 es SEC ID Nº : 86, HCDR2 es SEC ID Nº : 88, LCDR1 es SEC ID Nº : 94 y LCDR2 es SEC ID Nº : 96.

En realizaciones específicas, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) de SEC ID Nº : 108/110.

La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican dichos anticuerpos anti-NGF o fragmentos de los mismos. La invención abarca también vectores de expresión recombinante que portan los ácidos 55 nucleicos de la invención, y células hospedadoras en las que se han introducido dichos vectores, así como métodos para producir los anticuerpos cultivando las células hospedadoras en condiciones que permitan la producción de los anticuerpos, y recuperando los anticuerpos producidos.

La invención presenta un anticuerpo completamente humano o fragmento de anticuerpo que bloquea la actividad de NGF con una CI50 de menos de aproximadamente 10 nM, medida en un el ensayo basado en células PC12 in vitro (descrito posteriormente) . En una realización preferida, el anticuerpo de la invención muestra una CI50 de aproximadamente 500 pM o menos; aún más preferentemente, una CI50 de aproximadamente 100 pM o menos; aproximadamente 50 pM o menos; o aproximadamente 25 pM o menos.

La invención proporciona un anticuerpo humano aislado, o una parte de unión a antígeno del mismo, que se une con el NGF con una KD de menos de aproximadamente 1 pM, como se determina por resonancia de plasmón superficial

(BIACORE™) . En una realización preferida, el anticuerpo anti-NGF humano o fragmento de anticuerpo de la invención se une con el NGF humano con una KD de aproximadamente 0, 5 pM o menos. El anticuerpo o fragmento del mismo también se une preferentemente con NGF humano con una afinidad aproximadamente 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces mayor que con el NGF de rata y aproximadamente 2 veces, 2, 5 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces mayor que con el NGF de ratón.

En una realización preferida, el anticuerpo o fragmento del mismo muestra alta especificidad por el NGF humano, por ejemplo, no reacciona de forma cruzada con la neurotrofina-3 (NT-3) estrechamente relacionada. Por lo tanto, en 10 una realización preferida, el anticuerpo de alta afinidad y alta selectividad o fragmento del mismo muestra una KD, medida por resonancia de plasmón superficial, por el NGF humano de 1, 0 pM o menos, inhibe la unión del NGF con los receptores TrkA y p75, y no reacciona de forma cruzada con la NT-3 humana. La NT-3 desempeña un papel crítico en procesos fisiológicos tales como, por ejemplo, coordinación de las neuronas motoras musculares y, por lo tanto, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que no reaccionan de forma cruzada con NT-3 proporcionan una 15 ventaja terapéutica y clínica inesperada frente a los anticuerpos de la técnica anterior. Se ha mostrado que la NT-3 previene el desarrollo de hiperalgesia térmica en el modelo de CCI de dolor neuropático (véase, por ejemplo, Wilson-Gerwing et al. (2005) J Neuroscience 25: 58-767) . Más recientemente, se ha mostrado que la NT-3 exógena reduce significativamente la expresión de estos canales de sodio que parecen desempeñar un papel en la generación del dolor neuropático (Wilson-Gerwing y Verge (2006) Neuroscience 141: 2075-2085) . Estos datos sugieren un papel

beneficioso de la NT-3 en el dolor neuropático.

La invención abarca anticuerpos anti-NGF que tienen un patrón de glucosilación modificado. En algunas aplicaciones, la modificación para retirar sitios de glucosilación indeseables puede ser útil, o un anticuerpo que carece de un resto de fucosa presente en la cadena de oligosacáridos, por ejemplo, para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (véase Shield et al. (2002) JBC 277: 26733) . En otras aplicaciones, puede realizarse una modificación de la galactosilación para modificar la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) .

La invención presenta una composición que comprende un anticuerpo humano recombinante o fragmento del mismo que se une específicamente con NGF y un vehículo aceptable. En un aspecto relacionado, la invención presenta una composición que es una combinación de un inhibidor de NGF y un segundo agente terapéutico. En una realización, el inhibidor de NGF es un anticuerpo o fragmento del mismo. En una realización preferida, el segundo agente terapéutico es cualquier agente terapéutico adecuado que se combine provechosamente con un inhibidor de NGF.

La invención se refiere a la inhibición de la actividad de NGF humano usando el anticuerpo anti-NGF o parte de unión a antígeno del anticuerpo de la invención. El trastorno tratado es cualquier enfermedad o afección que se mejore, alivie, inhiba o prevenga por la retirada, inhibición o reducción de la actividad de NGF. Más específicamente, la invención se refiere al tratamiento de una afección o enfermedad mediada por NGF tal como dolor inflamatorio, dolor por incisión postoperatorio, síndrome de dolor regional complejo, dolor por cáncer de hueso metastásico o primario, dolor neuropático, dolor por fractura, dolor por fractura osteoporótico, dolor resultante de quemaduras, osteoporosis, dolor de articulación gotosa, dolores asociados con crisis de anemia falciforme, y otros dolores nocicépticos, así como carcinoma hepatocelular, cáncer de mama y cirrosis hepática, administrando un inhibidor de NGF, tal como el anticuerpo o... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente con el factor de crecimiento nervioso humano (NGF) con una KD de 1 pM o menos, medida por resonancia de plasmón superficial, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende

(a) una región determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (HCDR3) y una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) , donde la HCDR3 y LCDR3 comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en SEC ID Nº : 90 y 98, respectivamente, y

(b) una HCDR1, HCDR2, LCDR1 y LCDR2, donde la HCDR1 es SEC ID Nº : 86, HCDR2 es SEC ID Nº : 88, LCDR1 es SEC ID Nº : 94 y LCDR2 es SEC ID Nº : 96.

2. Un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, que se une específicamente con NGF humano con una KD de 0, 5 pM o menos.

3. Un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 o 2, donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera (LCVR) , donde la HCVR y LCVR comprenden secuencias de aminoácidos expuestas en SEC ID Nº : 108 y 110 respectivamente.

4. Un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, 2 o 3, que se une con NGF humano con una KD de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 veces mayor que con la que el anticuerpo o fragmento se une con NGF de rata y ratón.

5. Una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5.

7. Un método para producir un anticuerpo anti-NGF humano o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende las etapas de introducir el vector de expresión de la reivindicación 6 en una célula hospedadora aislada, cultivar la célula en condiciones que permitan la producción del anticuerpo o fragmento de anticuerpo, y recuperar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo producido de este modo, preferentemente donde la célula hospedadora es una célula de E. coli, una célula CHO o una célula COS.

8. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8 que comprende además un agente terapéutico adicional seleccionado de un inhibidor de interleucina-1 (IL-1) , un fármaco antiepiléptico, un antagonista de citocina, y una neurotrofina.

10. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso en un método para atenuar o inhibir una enfermedad o afección mediada por NGF en un ser humano seleccionada del dolor inflamatorio, dolor por incisión postoperatorio, dolor neuropático, dolor por fractura, dolor de articulación gotosa, neuralgia post-herpética, dolor resultante de quemaduras, dolor por cáncer, dolor por osteoartritis o artritis reumatoide, ciática, dolor asociado con crisis de anemia falciforme o neuralgia postherpética.

11. Uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la preparación de un medicamento para uso en un método para atenuar o inhibir una enfermedad o afección mediada por NGF en un ser humano seleccionada de dolor inflamatorio, dolor por incisión postoperatorio, dolor neuropático, dolor por fractura, dolor de articulación gotosa, neuralgia post-herpética, dolor resultante de quemaduras, dolor por cáncer, dolor por osteoartritis o artritis reumatoide, ciática, dolor asociado con crisis de anemia falciforme o neuralgia post-herpética.

12. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para el uso de acuerdo con la reivindicación 10, donde dicho método comprende administrar un primer y un segundo agente terapéutico a un sujeto humano que lo necesite, donde el primer agente terapéutico es dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, y preferentemente donde el segundo agente terapéutico es un inhibidor de interleucina-1 (IL-1) , un fármaco antiepiléptico, un antagonista de citocina o una neurotrofina.

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 11 de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho método comprende administrar un primer y un segundo agente terapéutico a un sujeto humano que lo necesite, en el que primer agente terapéutico es dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, y preferentemente donde el segundo agente terapéutico es un inhibidor de interleucina-1 (IL-1) ,

un fármaco antiepiléptico, un antagonista de citocina o una neurotrofina.

14. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para el uso de acuerdo con la reivindicación 10 o 12, donde la afección o enfermedad mediada por NGF se inhibe sin deterioro significativo de la coordinación motora.

15. Uso de acuerdo con la reivindicación 11 o 13 de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la afección o enfermedad mediada por NGF se inhibe sin deterioro significativo de la coordinación motora.