Un anticuerpo desinmunizado o fragmento de anticuerpo desinmunizado específico para un epítopo en el dímero D humano que reconoce la fibrina reticulada pero no el fibrinógeno,

en donde uno o más residuos de aminoácido en el dominio variable (v) de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo mutan para eliminar o reducir la asociación de fragmentos de péptido de dicho domino v con las moléculas MHC clase II, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una combinación de dominios v de cadena H y L que comprende una combinación de secuencias de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona de manera general con moléculas portadoras derivadas de una especie o cepa de animal o ave y que son sustancialmente no inmunogénicos que se exponen a un sistema inmune de una especie

o cepa de otra criatura animal o ave. Más particularmente, la presente invención proporciona moléculas inmunoreactivas desinmunizadas y aún más particularmente anticuerpos desinmunizados para uso en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.

ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN

Los detalles bibliográficos de las publicaciones denominadas en esta especificación se recolectan al final de la descripción.

No se hace referencia a ninguna técnica anterior en esta especificación, y no se debe tomar como, un conocimiento

o cualquier forma de sugerencia de que esta técnica anterior forma parte del conocimiento general común en cualquier país.

El fibrinógeno es una molécula de proteína grande que circula normalmente en el plasma sanguíneo en un estado disuelto. En la presencia de trombina, las moléculas de fibrinógeno forman polímeros como hebras largas o redes denominadas fibrina, que es el ingrediente primario de los coágulos de sangre.

Luego de la digestión con plasmina, el fibrinógeno forma fragmentos designados A-E. Los fragmentos D y E son los fragmentos predominantes y existe aproximadamente dos veces tanto D como de E. El fibrinógeno tiene una forma trinodular en donde el fragmento E es un componente central y el fragmento D es un componente terminal.

Las digestiones de plasmina de fibrina y fibrinógeno se pueden diferenciar una de la otra utilizando electrofóresis de gel de poliacrilamida (PAGE). La reticulación de fibrina con el Factor XIIIa forma los dímeros del fragmento D denominados dímeros D. El Factor XIIIa es una enzima que introduce enlaces covalentes entre monómeros adyacentes en fibrina (Budzynski et al., Blood 54(4): 794-804, 1979). El Factor XIIIa se activa mediante la remoción catalizada de trombina de un péptido de un precursor en plasma y en plaquetas de sangre. El dímero D es una molécula de aproximadamente 189,000 daltons que consiste esencialmente de dos grupos funcionales del fragmento D derivados de diferentes moléculas de fibrina unidas covalentemente mediante enlaces reticulados entre los remanentes de cadena γ de fibrinógeno. El fibrinógeno en sí mismo comprende seis cadenas con dos copias de una cadena α, β,y γ.

Otro complejo (DD)E se forma por la degradación de plasmina de fibrina humana reticulada y comprende una combinación de dos fragmentos D y fragmento E.

Otros derivados reticulados se describen por Graeff and Halfer (Graeff and Halfer, "Detection and Relevance of Cross-Linked Fibrin Derivatives in Blood", Seminars in Thrombosis and Hemostatis 8(1), 1982) y incluyen derivados reticulados de alto peso molecular tal como DY, YY, XD, XY, DXD y YXD.

La homeóstasis normal o la coagulación de la sangre involucran mantener constituyentes intravasculares en una fase líquida o suspensión mientras que permite concomitantemente la deposición local de componentes de sangre de fase sólida en áreas de daño de vaso. En la salud, se asume, pero nunca demuestra experimentalmente, que existe un balance entre un depósito intravascular de bajo grado de fibrina y su remoción mediante fibrinólisis o fagocitosis celular.

Las observaciones clínicas tempranas revelan que algunos de varios paciente desarrollan signos de hemorragia y aparición masiva de moretones y tiene tiempos de coagulación prolongados y trombocitopenia. En post-morten, en algunos casos, se demuestran trombos de fibrina en la microvasculatura. La naturaleza difusa de estos trombos da surgimiento a la coagulación intravascular diseminada (DIC) también conocido como coagulopatía de consumo. Posteriormente, las trombinas se asocian con condiciones tal como trombosis de vena profunda (DVT) y embolismo pulmonar (PE).

Las condiciones tal como DIC, DVT y PE involucran la activación del sistema de coagulación que resulta en el consumo de plaqueta, la generación de trombina, depósito de fibrina y fibrinólisis secundaria. El efecto biológico neto de este proceso refleja un balance entre el depósito de fibrina y la remoción de fibrina. Las manifestaciones clínicas resultantes pueden ser hemorragia, cuando predomina el agotamiento de los factores predominantes, o el daño de tejido isquémico, debido a los efectos de oclusión vascular entre otras condiciones.

Se han reportado DIC, DVT y PE como un fenómeno secundario una amplia variedad de trastornos, particularmente aquellos acompañados por una combinación de choque, acidosis e hipoxemia. Las asociaciones clínicas bien reconocidas son sepsis, trauma principal, malignidad y trastornos obstétricos. Recientemente, se ha reconocido el DVT como un problema particular durante el viaje de aire prolongado u otra inmovilidad prolongada. En cualquier evento, la activación de la secuencia de coagulación resulta en el consumo de la proteína de coagulación y las plaquetas, que conduce a depósitos de fibrina en la microcirulación.

De forma ideal, un diagnóstico definitivo de condiciones tal como DIC, DVT y PE requiere la demostración directa del depósito de fibrina difuso. La dificultad práctica para obtener múltiples evidencias de biopsias directas para diferenciar entre la formación de fibrina localizada y generalizada ha conducido al desarrollo de las pruebas indirectas que se sustituyen como puntos finales de diagnóstico. Sin embargo, estas pruebas no son específicas para el síndrome de depósito de fibrina intravascular. Su especificidad se reduce adicionalmente mediante la acción de otras enzimas que aunque no son capaces de convertir el fibrinógeno a fibrina pueden originar alteraciones similares a la trombina en los otros factores de coagulación involucrados en la trombosis. Todas las pruebas indirectas se basan en el principio que la trombina es solo la enzima (venenos de serpiente excluidos) capaz de convertir el fibrinógeno a fibrina en los mamíferos.

También, aparte de las pruebas de paracoagulación que detectan la presencia de circular complejos de monómero de fibrina solubles, ninguna de las pruebas de trombina más específicas está disponible fácilmente o es útil para la aplicación clínica inmediata en el diagnóstico de estas condiciones asociadas con fibrina. Estas pruebas incluyen la prueba FPA (fibrinopéptido A) en donde se mide FPA mediante un procedimiento RIA específico, ensayos de monómero de fibrina, cromatografías de exclusión de gel de fibrinógeno y pruebas para FPB (fibrinopéptido B) o FPB de trombina incrementada.

Las pruebas sin especificidad bioquímica para la acción de trombina incluyen las pruebas de tiempo de protrombina (PT), el tiempo de tromboplastina (A PTT) y el tiempo de coagulación trombina (TCT). Aunque frecuentemente utilizado en la práctica, se debe reconocer que la información obtenida de estas pruebas no es específica en naturaleza, que actúa como una medición de un agotamiento del factor de coagulación independiente de la etiología.

Se ha encontrado que los ensayos de factor de coagulación son relativamente no específicos y estos incluyen ensayos para los cofactores V y VIII así como también pruebas para los niveles de fibrinógeno.

Las pruebas para los productos de degradación de fibrina-fibrinógeno no se han aprobado por ser específicos para la acción de plasmina en fibrina y pueden proporcionar resultados positivos en donde ha habido fibrinólisis sin la acción de trombina anterior en la molécula de fibrinógeno. Estas pruebas incluyen los fragmentos D y E.

Las pruebas para la interacción de plaqueta mediada por trombina o la liberación se han encontrado que no son específicos en naturaleza. Estos incluyen conteo de plaquetas, supervivencia de las plaquetas y pruebas para la liberación de plaquetas.

También se ha intentado el uso de fibrinógeno radiomarcado en relación con la identificación de los factores de coagulación pero se encuentra que consume tiempo y es difícil de realizar.

Así, la eficiencia de una prueba diagnóstica se basa en su capacidad de indicar la presencia o ausencia de la enfermedad. Existen principios esenciales bien reconocidos para estudios que determinan la eficacia de una prueba diagnóstica que permite los cuatro índices de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo desinmunizado o fragmento de anticuerpo desinmunizado específico para un epítopo en el dímero D humano que reconoce la fibrina reticulada pero no el fibrinógeno, en donde uno o más residuos de aminoácido en el dominio variable (v) de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo mutan para eliminar o reducir la asociación de fragmentos de péptido de dicho domino v con las moléculas MHC clase II, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una combinación de dominios v de cadena H y L que comprende una combinación de secuencias de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste de:

SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5.

2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo desinmunizado de la reivindicación 1 en donde dicho anticuerpo o fragmento es específico para un epítopo reconocido por el anticuerpo 3B6 monoclonal de murino anti-fibrina.

3. Uso del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 o 2 en donde dicho anticuerpo se marca con una molécula reportera para la fabricación de un agente formador de imágenes para detectar un coágulo de sangre en un paciente humano en donde en la introducción de dicho anticuerpo en dicho paciente a dicho anticuerpo marcado se le permite diseminar a través del sistema circulatorio y en donde el paciente se somete a un protocolo de formación de imágenes para visualizar el coágulo.

4. El uso de la reivindicación 3 en donde dicho protocolo de formación de imágenes es MRI, exploración CT, ultrasonido o exploración de medicina nuclear tomográfica asistida por computador que incluye Cámara de gamagrafía gama o PET.

5. El uso de la reivindicación 3 en donde dicha molécula reportera es una etiqueta nuclear.

6. El uso de la reivindicación 5 en donde dicha etiqueta nuclear es 99mTc, 18F, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 97Ru, 111In, 123I, 124I, 131I o 188Re.

7. El uso de la reivindicación 6 en donde dicha etiqueta nuclear es 99mTc.

8. Uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpos de la reivindicación 1 o 2 para la fabricación de un medicamento para facilitar la disolución, prevención de crecimiento o remoción de un coágulo de sangre en un humano en donde dicho anticuerpo comprende adicionalmente una disolución del coágulo o agente de prevención de crecimiento de coágulos fusionados, unidos o de otra forma asociados a esto.

9. Un conjugado que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 o 2 y una o ambas de una etiqueta de formación de imágenes y/o un agente terapéutico.

10. El conjugado de la reivindicación 9 en donde dicha etiqueta formadora de imágenes es un MRI-, ultrasonido-, CT-, o medicina nuclear (que incluye cintigrafía de cámara gama y etiqueta tipo PET.

11. El conjugado de la reivindicación 10 en donde dicha etiqueta formadora de imágenes se selecciona de 99mTc, 18F, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 97Ru, 111In, 123I, 124I, 131I y 188Re.

12. El conjugado de la reivindicación 11 en donde dicha etiqueta formadora de imágenes es 99mTc.

13. El conjugado de la reivindicación 9 en donde dicho agente terapéutico es un agente anticoagulación o una citoquina.

14. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 5 a 7 en donde el protocolo de formación de imágenes es una exploración de medicina nuclear tomográfica asistida por computador o plana.

15. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 o 2 en donde dicho anticuerpo se marca con una molécula reportera para uso in vivo para detectar un coágulo de sangre en un paciente humano en donde en la introducción de dicho anticuerpo en dicho paciente dicho anticuerpo marcado se le permite diseminar a través del sistema circulatorio y en donde el paciente se somete a un protocolo de formación de imágenes para visualizar el coágulo.

16. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 15 en donde dicho protocolo de formación de imágenes es MRI, exploración CT, ultrasonido o exploración de medicina nuclear tomográfica asistida por computador que incluye cintigrafía de cámara gama o PET.

17. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 15 en donde dicha molécula reportera es una 5 etiqueta nuclear.

18. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 17 en donde dicha etiqueta nuclear es 99mTc. 18F, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 97Ru, 111In, 123I, 124I, 131I o 188Re.

19. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 18 en donde dicha etiqueta nuclear es 99mTc.

20. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 o 2 para uso in vivo para facilitar la disolución,

10 prevención de crecimiento o remoción de un coágulo de sangre en un humano en donde dicho anticuerpo comprende adicionalmente una disolución del coágulo o agente de prevención de crecimiento de coágulos fusionados, unidos o de otra forma asociados a esto.

21. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 15 o 17 a 19 en donde el

protocolo de formación de imágenes es una exploración de medicina nuclear tomográfica asistida por computador o 15 plana.