Anticuerpos humanizados contra receptores de tipo Toll 2 y sus usos.

Un anticuerpo neutralizante, o una de sus porciones de unión al antígeno,

que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO:1, o una secuencia que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:1, y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO:4, o una secuencia que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:4, en el que el anticuerpo o la porción de unión al antígeno se une específicamente al dominio extracelular del receptor de tipo Toll 2 y antagoniza la función del receptor de tipo Toll 2, en el que dicho antagonismo es mediado independientemente de la unión del anticuerpo, o de una de sus porciones de unión al antígeno, a CD32.

Anticuerpos humanizados contra receptores de tipo Toll 2 y sus usos Campo de la invención La presente invención se refiere a anticuerpos totalmente humanizados y sus fragmentos y, en particular, a anticuerpos totalmente humanizados que presentan especificidad de unión por el receptor de tipo Toll 2 (TLR2, TLR2) . La invención también se refiere al uso de dichos anticuerpos totalmente humanizados para el tratamiento y la prevención de enfermedades inflamatorias y autoinmunológicas mediadas por la activación y la señalización del receptor de tipo Toll 2.

Antecedentes de la invención Los receptores de tipo Toll (TLR) forman una familia de receptores de reconocimiento de patrones que desempeñan un papel clave en la modulación de la respuesta inmunológica innata, y también están implicados en la reparación de tejidos, el mantenimiento de la integridad de los tejidos y la tumorigénesis. Hasta la fecha se han identificado once receptores de tipo Toll en seres humanos. Los miembros de la familia del receptor de tipo Toll están muy conservados, y la mayoría de las especies de mamífero tienen entre 10 y 15 receptores de tipo Toll. Cada receptor de tipo Toll reconoce firmas moleculares asociadas a patógenos específicas. El receptor de tipo Toll 2 (TLR2, CD282, TLR-2) puede ser activado por peptidoglicanos, lipoproteínas, ácido lipoteicoico y ligandos endógenos.

Se conocen una serie anticuerpos monoclonales que tienen especificidad de unión por el receptor de tipo Toll 2. El documento WO 01/36488 describe un anticuerpo, denominado TL2.1, que se deriva de una línea celular de hibridoma depositada según el tratado de Budapest en the European Collection of Cell Cultures (ECACC) con el número de registro 99102832. Este anticuerpo antagoniza la activación del receptor de tipo Toll 2 expresado en células humanas.

El documento WO 2005/028509 describe un anticuerpo monoclonal murino, denominado T2.5, que inhibe específicamente la activación del TLR2 humano. Se ha demostrado que el anticuerpo monoclonal T2.5 presenta reacción cruzada con las formas humana y murina de TLR2. Este documento también contiene datos experimentales que sugieren que el anticuerpo monoclonal anti-TLR2 TL2.1 murino, tal como se describe en el documento WO 01/36488, no presenta reacción cruzada con las formas humana y murina de TLR2, tal como se indica en la memoria descriptiva de esta solicitud de patente. Por el contrario, en el documento WO 2005/028509, se demuestra que el anticuerpo TL2.1 solo se une al receptor de tipo Toll 2 humano y no al receptor de tipo Toll 2 murino. El anticuerpo monoclonal T2.5 del documento WO 2005/028509 se generó contra el dominio extracelular de TLR2 y, por tanto, presenta especificidad de unión con un epitopo en el área del receptor de tipo Toll 2.

El documento WO 2005/019431 describe una anticuerpo que presenta especificidad de unión al TLR2, que se denomina 11G7. Este anticuerpo murino puede obtenerse a partir de la línea celular de hibridoma 11G7, depositada en the American Type Culture Centre (ATCC) con la denominación PTA-5014. El anticuerpo monoclonal 11G7 se une selectivamente al dominio extracelular de TLR2 y puede bloquear la inducción de la producción de citoquinas por las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas estimuladas con un agonista que activa un heterodímero formado entre el receptor de tipo Toll 1 (TLR1) y TLR2. El anticuerpo 11G7 no inhibe la producción de citoquinas por PBMC estimuladas con un agonista que induce la señalización a través de un heterodímero formado entre el receptor de tipo Toll 6 (TLR6) y TLR2.

El uso de anticuerpos monoclonales de roedor, tales como anticuerpos monoclonales murinos, para aplicaciones terapéuticas in vivo, ha demostrado estar asociado con la generación de respuestas inmunológicas no deseadas, que son generadas por el sujeta al cual se administra el anticuerpo. Estas respuestas inmunológicas pueden provocar la producción de anticuerpos que neutralicen, de modo eficaz, la eficacia del anticuerpo terapéutico. Estas respuestas inmunológicas generalmente se denominan respuestas de anticuerpos antirratón humanos (HAMA) . Las respuestas HAMA comprometen la eficacia terapéutica del anticuerpo administrado a través de una serie de vías, que incluyen alterar la capacidad del anticuerpo terapéutico para alcanzar su diana de unión, compremetiendo así el efecto terapéutico del anticuerpo.

Se han desarrollado una serie de estrategias para solucionar la cuestión de las respuestas HAMA no deseadas que se generan contra anticuerpos terapéuticos que se administran a individuos. Generalmente, estas estrategias implican técnicas que dan como resultado la sustitución de ciertos componentes del anticuerpo de ratón por porciones equivalentes derivadas de un anticuerpo humano. Estas estrategias pueden originar, por ejemplo, la producción de anticuerpos quiméricos que comprenden regiones variables murinas unidas a regiones constantes derivadas de seres humanos. Como alternativa, puede emplearse una técnica conocida como “injerto de CDR”, en la que regiones determinantes de la complementariedad (CDR) procedentes de un anticuerpo murino se injertan en un marco proporcionado por regiones de dominios variables de cadena ligera y pesada de anticuerpos humanos. Esto da como resultado la producción de un anticuerpo que conserva la especificidad de unión del anticuerpo murino, pero en el que los únicos componentes no humanos son las regiones CDR murinas injertadas.

Sin embargo, en ambas estrategias, la eficacia terapéutica del anticuerpo humanizado resultante puede verse alterada. Por ejemplo, el componente de la región variable murina de un anticuerpo quimérico todavía puede proporcionar la base para que una respuesta HAMA se genere con él. Además, cuando se han producido anticuerpos humanizados con injertos de CDR, se ha observado que el simple transplante de las regiones CDR a menudo da como resultado una eficacia terapéutica reducida del anticuerpo debido a que la afinidad de unión del anticuerpo disminuye.

Por tanto, el inventor ha identificado la necesidad de generar anticuerpos monoclonales totalmente humanizados que tengan especificidad de unión por el receptor de tipo Toll 2, y que antagonicen la función de TLR2, pero que sean fundamentalmente no inmunogénicos en seres humanos. Después de una intensiva labor de experimentación, el inventor ha producido un anticuerpo monoclonal totalmente humanizado que tiene especificidad de unión con el receptor de tipo Toll 2 humano y que antagoniza la función de TLR2, independientemente de si el receptor de tipo Toll 2 forma un heterodímero con el receptor de tipo Toll 1 o el receptor de tipo Toll 6. Este anticuerpo antagonista de TLR2 no se produce mediante técnicas de injerto de CDR o quiméricas previamente conocidas y, por tanto, no contiene restos aminoácidos murinos. Además, se demuestra que el anticuerpo media en la neutralización de TLR2 sin necesidad de unirse al antígeno de la superficie celular CD32, siendo este un requisito funcional de otros anticuerpos antagonistas del receptor de tipo Toll 2 conocidos. Además, el anticuerpo totalmente humanizado de la invención es el primer anticuerpo neutralizante de TLR2 totalmente humano que se conoce en la técnica. El anticuerpo no muestra epitopos de células T y, por tanto, no se generan anticuerpos neutralizantes contra él cuando se administra a un sujeto. Los anticuerpos antagonistas anti-TLR2 también muestran un amplio nivel de reactividad cruzada con el receptor de tipo Toll 2, según es expresado por una amplia gama de células de mamífero, habiéndose observado, de modo sorprendente, que el anticuerpo totalmente humanizado se une al receptor de tipo Toll 2 expresado en células de mono, ratón y humanas.

Sumario de la invención Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo neutralizante, o una de sus porciones de unión al antígeno, que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO:1, o una secuencia que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:1, y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO:4, o una secuencia que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:4, en el que el anticuerpo o la porción de unión al antígeno se une específicamente con el dominio extracelular del receptor de tipo Toll 2 (TLR2, CD282, TLR2) y antagoniza la función del receptor de tipo Toll 2, en el que dicho antagonismo es mediado independientemente de la unión del anticuerpo, o de una de sus porciones de unión al antígeno, a CD32.

Tal como se define en la presente, la expresión anticuerpo neutralizante describe un anticuerpo que es capaz... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo neutralizante, o una de sus porciones de unión al antígeno, que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO:1, o una secuencia que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:1, y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO:4, o una secuencia que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO:4, en el que el anticuerpo o la porción de unión al antígeno se une específicamente al dominio extracelular del receptor de tipo Toll 2 y antagoniza la función del receptor de tipo Toll 2, en el que dicho antagonismo es mediado independientemente de la unión del anticuerpo, o de una de sus porciones de unión al antígeno, a CD32.

2. El anticuerpo neutralizante del receptor de tipo Toll 2 según la reivindicación 1, en el que el dominio variable de la cadena ligera se une a un dominio constante kappa.

3. El anticuerpo neutralizante del receptor de tipo Toll 2 según la reivindicación 1 o 2, en el que el dominio variable de la cadena pesada se une a un dominio constante derivado de un anticuerpo de la subclase de la inmunoglobulina G, isotipo 4.

4. El anticuerpo neutralizante del receptor de tipo Toll 2 según la reivindicación 3, en el que el resto aminoácido 241 de una región de bisagra de la cadena pesada está sustituido de un resto serina a un resto prolina.

5. El anticuerpo neutralizante del receptor de tipo Toll 2 según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

6. El anticuerpo neutralizante del receptor de tipo Toll 2 según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5.

7. El anticuerpo neutralizante del receptor de tipo Toll 2 o la porción de unión al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo es un anticuerpo totalmente humanizado.

8. El anticuerpo neutralizante del receptor de tipo Toll 2 o la porción de unión al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo es un anticuerpo aislado.

9. El anticuerpo neutralizante del receptor de tipo Toll 2 o la porción de unión al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo o la porción de unión al antígeno se une al receptor de tipo Toll 2 humano con una KD de 3 x 10-8 M o menor.

10. El anticuerpo neutralizante del receptor de tipo Toll 2 o la porción de unión al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio variable de cadena ligera comprende SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9, y el dominio variable de cadena pesada comprende SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12.

11. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo o la porción de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 11.

13. Una célula hospedante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 12.

14. Un método para preparar el anticuerpo del receptor de tipo Toll 2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende las etapas de expresar el anticuerpo en la célula hospedante de la reivindicación 13, y aislar el anticuerpo de la célula hospedante.

15. Un anticuerpo, o una de sus porciones de unión al antígeno, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para su uso para tratar o prevenir una enfermedad o un trastorno inflamatorio, respiratorio o autoinmunológico que está mediado por la activación del receptor de tipo Toll 2, en el que la enfermedad o el trastorno inflamatorio, respiratorio o autoinmunológico se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, respuesta alérgica, psoriasis, dermatitis, esclerosis múltiple, aterosclerosis, lesión por isquemia-reperfusión, isquemia-reperfusión que se origina de un transplante de órganos, enfermedad ocular, uveities, degeneración macular relacionada con la edad, inflamación renal y diabetes.

16. Una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo, o una de sus porciones de unión al antígeno, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

Figura 11