Una proteína de unión a antígeno caracterizada porque es capaz de unir hepcidina-25 humana,

y porque comprende la VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 de la cadena pesada y la VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo AN-LP1 producidas por el hibridoma CNCM I-3794 y codificadas por las SEQ ID NOs 2- 4 y 6-8, respectivamente.

Anticuerpos especificos para la hepcidina humana La presente invención se refiere a anticuerpos o fragmentos de estos que reconocen la forma madura de la hepcidina humana y a su uso para tratar y diagnosticar enfermedades asociadas con la hepcidina.

El hierro es un elemento esencial que se requiere para el crecimiento y supervivencia de casi todos los organismos. Por lo tanto, las alteraciones en el metabolismo del hierro se han implicado en varias enfermedades significativas de mamiferos, incluyendo, pero no limitadas a anemia por deficiencia de hierro, hemosiderosis o la enfermedad de sobrecarga de hierro hemocromatosis (PIETRANGELO, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 282, G403-14, 2002; ANDREWS, Annu Rev Genomics Hum Genet, 1, 75-98, 2000; PHILPOTT, Hepatology, 35, 993-1001, 2002;

ANDERSON y POWELL, Int J Hematol, 76, 203-7, 2002; BEUTLER et al., Drug Metab Dispos, 29, 495-9, 2001) .

La deficiencia de hierro es el trastorno nutricional mas comun en el mundo. Hasta 4-5 billones de personas (es decir, 65-80% de la población mundial) puede ser deficiente en hierro y 2 billones de personas (mas del 30% de la población mundial, la mayor parte ninos y mujeres con edad de tener ninos) son anemicos, debido principalmente a deficiencia de hierro. La deficiencia de hierro afecta a mas gente que ninguna otra afección, constituyendo una afección de salud publica de proporciones epidemicas.

En los mamiferos, el equilibrio del hierro esta regulado principalmente al nivel de la absorción duodenal del hierro de la dieta. Despues de la absorción, el hierro ferrico se carga en apo-transferrina en la circulación y se transporta a los tejidos, incluyendo los precursores eritroides, donde es captado por endocitosis mediada por el receptor de la transferrina. Los macrófagos reticuloendoteliales juegan un papel principal en el reciclado del hierro de la 20 degradación de la hemoglobina de los eritrocitos senescentes, mientras los hepatocitos contienen la mayor parte del almacenamiento del hierro del organismo en polimeros de ferritina. Existe un mecanismo de retroalimentación que aumenta la absorción del hierro en individuos que son deficientes en hierro, mientras la absorción del hierro se reduce en personas con sobrecarga de hierro. En la hemocromatosis hereditaria (HH) , sin embargo, este mecanismo regulador parece que esta alterado; a pesar de una sobrecarga de hierro, cantidades elevadas de hierro se 25 absorben de la dieta y da lugar a la acumulación de hierro en exceso en órganos internos, lo que resulta en la disfunción y fallo organico. El mecanismo molecular por el que el intestino responde a las alteraciones de los requerimientos de hierro del cuerpo no se entiende bien. En este contexto se ha mostrado que la hepcidina, un peptido de mamiferos identificado recientemente (KRAUSE et al., FEBS Lett, 480, 147-50, 2000; PARK et al., J Biol Chem, 276, 7806-10, 2001) , es un componente de senalización clave que regula la homeostasis del hierro (NICOLAS et al., Proc Natl Acad Sci USA, 99, 4596-601, 2002) .

La hepcidina regula la homeostasis del hierro uniendose al exportador de hierro celular ferroportina y causando su internalización y degradación (NEMETH et al., Science, 306, 2090-3, 2004) . La consecuencia de la degradación de la ferroportina es la retención del hierro en las celulas y asi una disminución del hierro circulante. Por este mecanismo, la hepcidina disminuye el flujo de salida del hierro desde los tejidos exportadores de hierro en el plasma y asi reduce la absorción del hierro de la dieta, liberación del hierro reciclado de los macrófagos, liberación del hierro almacenado en los hepatocitos y transferencia del hierro a traves de la placenta.

La hepcidina es un peptido pequeno rico en cisteina producido principalmente en el higado. Esta molecula regula la absorción del hierro en el intestino e inhibe la liberación del hierro de los macrófagos. La hepcidina se aisl6 inicialmente de plasma y orina humanos como un peptido de 25 aminoacidos (aa) que presentaba una actividad 40 antimicrobiana (KRAUSE et al., FEBS Lett, 480, 147-50, 2000; PARK et al., J Biol Chem, 276, 7806-10, 2001) . Los ADNc de hepcidina que codifican un precursor de 83 aa en ratones y un precursor de 84 aa en rata y ser humano, incluyendo un peptido senal putativo de 24 aa, se identificaron posteriormente buscando genes especificos del higado que estuvieran regulados por el hierro (PIGEON et al., J Biol Chem, 276, 7811-9, 2001) . La hepcidina humana se expresa como un prepropeptido de 84 aminoacidos que se procesa en el amino terminal en un precursor 45 de 60 residuos de aminoacidos (prohepcidina) de aproximadamente 10 kDa, que se procesa adicionalmente en un peptido maduro de 25 aminoacidos (hepcidina-25) de aproximadamente 3 kDa. Ademas de la forma de 25 aminoacidos, tambien se detectaron formas de 20 y 22 aminoacidos truncadas en el N-terminal en orina (PARK et al., J Biol Chem, 276, 7806-10, 2001) . Sin embargo, estas variantes truncadas en N no parecen tener una función reguladora del hierro (RIVERA et al., Blood, 106, 2196-9, 2005; NEMETH et al., Blood, 107, 328-33, 2006) . De 50 acuerdo con esto, se admite generalmente que la hepcidina-25 es la forma bioactiva que es responsable principalmente del efecto hipoferremico de la hepcidina.

La hepcidina es un regulador central de la homeostasis del hierro. La deficiencia en hepcidina juega un papel central en la mayor parte de los trastornos de sobrecarga de hierro y tambien se ha mostrado que el exceso de hepcidina esta implicado en varias formas de anemia. Por ejemplo, Nicolas G, et al (2002) mostraron que la sobreexpresión de 55 hepcidina resultaba en anemia grave en ratones transgenicos (NICOLAS et al., Proc Natl Acad Sci USA, 99, 4596601, 2002) . Un estudio reciente indicó que la hepcidina es un mediador clave de anemia de inflamación (NEMETH et al., Blood, 101, 2461-3, 2003) . Ademas, una concentración anormalmente alta de hepcidina se ha indicado en anemia con diferentes etiologias, tales como anemia asociada con enfermedad renal (TOMOSUGI et al., Blood, 108,

1381-7, 2006) , anemia asociada con sepsis grave (KEMNA et al., Blood, 106, 3268-70, 2005) , anemia asociada con la enfermedad de Crohn (SEMRIN et al., Inflamm Bowel Dis, 12, 1101-6, 2006) y anemia refractaria a hierro asociada con adenomas hepaticos (WEINSTEIN et al., Blood, 100, 3776-81, 2002) .

Debido a la implicación de la hepcidina en trastornos de homeostasis del hierro, se han propuesto varios ensayos para su detección y cuantificación en plasma u orina con vistas al diagnóstico y monitorización de estos trastornos.

Sin embargo, el desarrollo de reactivos inmunoquimicos se ha visto dificultado por la falta de disponibilidad de anticuerpos anti-hepcidina. Se ha descrito un ensayo inmunoquimico usando anticuerpos de conejo policlonales antihepcidina (NEMETH et al., Blood, 101, 2461-3, 2003) pero este sólo permite cuantificar la hepcidina en orina y no en plasma. Tambien se han descrito antisueros de conejo producidos frente a los aa 28-47 (EG (1) -HepN y EG (2) -HepN) y los aa 70-84 (EG (1) -HepC) de prohepcidina (solicitud PCT WO 2004N058044; (KULAKSIZ et al., Gut, 53, 735-43, 2004) . Estos antisueros detectaron prohepcidina en suero humano; sin embargo, ninguno de ellos reconoci6 la hepcidina-25 bioactiva.

US 2007N224186 describe anticuerpos monoclonales producidos en ratones frente al peptido que abarca los residuos 74-81 de la pro-hepcidina humana.

Hasta ahora, no se ha descrito ningun anticuerpo capaz de reconocer la hepcidina-25 en suero y los unicos ensayos disponibles para la determinación de hepcidina-25 en suero se basan en espectrometria de masas (TOMOSUGI et al., Blood, 108, 1381-7, 2006) (MURPHY et al., Blood, 110, 1048-54, 2007) .

Ademas, los anticuerpos que actuan como antagonistas de la hepcidina, es decir capaces de inhibir la unión de la hepcidina a ferroportina y la posterior internalización y degradación de la ferroportina, serian utiles en el tratamiento de afecciones que resultan de un exceso de hepcidina.

Asi, los anticuerpos que reconocen la hepcidina-25 y que permiten su determinación en suero y que ademas son capaces de inhibir la unión de la hepcidina a la ferroportina parecen altamente deseables.

Los inventores han tenido ahora exito en la obtención de dicho anticuerpo.

Este anticuerpo monoclonal, designado de aqui en adelante en la presente memoria "AN-LP1" es producido por el hibridoma depositado segun los terminos del Tratado de Budapest, en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur... [Seguir leyendo]

REIvINDICACIONES

1. Una proteina de unión a antigeno caracterizada porque es capaz de unir hepcidina-25 humana, y porque comprende la VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 de la cadena pesada y la VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo AN-LP1 producidas por el hibridoma CNCM I-3794 y codificadas por las SEQ ID NOs 2

4 y 6-8, respectivamente.

2. Una proteina de unión a antigeno segun la reivindicación 1, caracterizada porque se selecciona entre: a) el anticuerpo monoclonal AN-LP1 producido por el hibridoma CNCM I-3794; b) los fragmentos de unión a antigeno del anticuerpo AN-LP1; c) los anticuerpos quimericos o humanizados obtenidos de AN-LP1;

d) los fragmentos de unión a antigeno de los anticuerpos c) anteriores.

3. Una proteina de unión a antigeno segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada porque es capaz de inhibir la unión de hepcidina a ferroportina.

4. Un polinucleótido que codifica una proteina de unión a antigeno segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la reivindicación 4.

6. Una celula que expresa una proteina de unión a antigeno segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. Una celula de la reivindicación 6, que es el hibridoma CNCM I-3794.

8. Una celula de la reivindicación 6, que es una celula huesped transformada con un vector de expresión de la reivindicación 5.

9. Un metodo para preparar una proteina de unión a antigeno segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,

caracterizado porque comprende cultivar al menos una celula segun se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 y recuperar dicha proteina de dicho cultivo.

10. El uso de una proteina de unión a antigeno segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para detectar hepcidina en una muestra biológica.

11. El uso de una proteina de unión a antigeno segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para el diagnóstico in 25 vitro de una enfermedad asociada con niveles anormales de hepcidina.

12. Una proteina de unión a antigeno segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para uso como un medicamento.

DifººResp.