Un anticuerpo de IgG aislado o uno de sus fragmentos que unen específicamente el dominio extracelular de FcyRIIB expresado de forma endógena en una célula humana con una afinidad al menos 10 veces mayor que con la que dicho anticuerpo o fragmento unen FcyRIIA expresado de forma endógena en una célula humana,

en el que dicha unión es a través del dominio variable.

Anticuerpos específicos frente a FcgammaRIIB y sus procedimientos de uso

Campo técnico

La presente divulgación se refiere a anticuerpos o sus fragmentos que unen específicamente FcyRIIB, en particular FcyRIIB humano, con una afinidad mayor que con la que dichos anticuerpos o sus fragmentos unen FcyRIIA, en particular FcyRIIA humano. La divulgación proporciona procedimientos para potenciar el efecto terapéutico de anticuerpos terapéuticos administrando los anticuerpos de la invención para potenciar la función efectora de los anticuerpos terapéuticos. La divulgación también proporciona procedimientos para potenciar la eficacia de una composición de vacuna administrando los anticuerpos de la invención.

10 Antecedentes

2.1 Receptores de Fc y su papel en el sistema inmunitario La interacción de complejos anticuerpo-antígeno con células del sistema inmunitario da como resultado una amplia variedad de respuestas, que van desde funciones efectoras tales como la citotoxicidad dependiente de anticuerpos, la desgranulación de mastocitos y la fagocitosis frente a señales inmunomoduladoras tales como la regulación de la proliferación de linfocitos y la secreción de anticuerpos. Todas estas interacciones se inician a través de la unión del dominio Fc de anticuerpos o complejos inmunitarios a receptores de superficie celular especializados sobre células hematopoyéticas. La diversidad de respuestas celulares desencadenadas por anticuerpos y complejos inmunitarios resulta de la heterogeneidad estructural de los receptores de Fc. Los receptores de Fc comparten dominios de unión de ligando relacionados estructuralmente que presumiblemente median la señalización intracelular.

Los receptores de Fc, miembros de la superfamilia de proteínas de genes de inmunoglobulina, son glucoproteínas de superficie que pueden unir la porción Fc de moléculas de inmunoglobulina. Cada miembro de la familia reconoce inmunoglobulinas de uno o más isotipos a través de un dominio de reconocimiento de la cadena a del receptor de Fc. Los receptores de Fc se definen por su especificidad para los subtipos de inmunoglobulina. Los receptores de Fc para IgG se denominan FcyR, para IgE, Fc£R y para IgA FcaR. Diferentes células accesorias portan receptores de Fc para anticuerpos de isotipo diferente y el isotipo del anticuerpo determina qué células accesorias participarán en una determinada respuesta (revisado por Ravetch J.V. y col. 1991, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92; Gerber J.S. y col. 2001 Microbes and Infection, 3: 131-139; Billadeau D.D. y col. 2002, The Journal of Clinical Investigation, 2 (109) : 161-1681; Ravetch J.V. y col. 2000, Science, 290: 84-89; Ravetch J.V. y col., 2001 Annu. Rev. Immunol. 19:275-90; Ravetch J.V. 1994, Cell, 78 (4) : 553-60) . Los diferentes receptores de Fc, las células que los expresan y su especificidad de isotipo se resumen en la Tabla 1 (adaptada de Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4ª ed. 1999, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, Nueva York) .

Receptores Fcy Cada miembro de esta familia es una glucoproteína de membrana integral, que posee dominios extracelulares relacionados con un conjunto C2 de dominios relacionados con inmunoglobulina, un dominio único que se extiende por la membrana y un dominio intracitoplásmico de longitud variable. Existen tres FcyR conocidos, llamados FcyRI (CD64) , FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) . Los tres receptores están codificadas por genes distintos; sin embargo, la extensa homología entre los tres miembros de la familia sugiere que surgieron de un origen común, quizás por duplicación génica. Esta invención se centra específicamente en los FcyRII (CD32) .

FcyRII (CD32)

Las proteínas FcyRII son glucoproteínas de membrana integrales de 40 KDa que sólo unen las IgG complejadas debido a una baja afinidad por Ig monomérica (106 M-1) . Este receptor es el FcyR más ampliamente expresado, presente en todas las células hematopoyéticas, incluyendo monocitos, macrófagos, linfocitos B, linfocitos NK, neutrófilos, mastocitos y plaquetas. FcyRII sólo tiene dos regiones de tipo inmunoglobulina en su cadena de unión a inmunoglobulina y, por tanto, una afinidad mucho menor por IgG que FcyRI. Existen tres genes de FcyRII humano 45 (FcyRII-A, FcyRII-B, FcyRII-C) , todos lo cuales unen IgG en agregados o complejos inmunitarios.

Distintas diferencias dentro de los dominios citoplásmicos de FcyRII-A y FcyRII-B crean dos respuestas funcionalmente heterogéneas frente a la unión al receptor. La diferencia fundamental es que la isoforma A inicia la señalización intracelular que conduce a la activación celular tal como la fagocitosis y el estallido respiratorio, mientras que la isoforma B inicia señales inhibidoras, p. ej., inhibiendo la activación de linfocitos B.

50 Señalización a través de FcyR

Tanto las señales activadoras como las inhibidoras se transducen a través de los FcyR tras la unión. Estas funciones diametralmente opuestas son resultado de las diferencias estructurales entre las diferentes isoformas del receptor. Dos dominios diferentes dentro de los dominios de señalización citoplásmicos del receptor denominados motivos de activación del inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM) o motivos inhibidores del inmunorreceptor basados en

tirosina (ITIM) son responsables de las diferentes respuestas. El reclutamiento de diferentes enzimas citoplásmicas a estas estructuras determina el resultado de las respuestas celulares mediadas por FcyR. Los complejos de FcyR que contienen ITAM incluyen FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, mientras los complejos que contienen ITIM sólo incluyen FcyRIIB.

Los neutrófilos humanos expresan el gen FcyRIIA. La agrupación de FcyRIIA mediante complejos inmunitarios o entrecruzamiento específico de anticuerpos sirve para agregar ITAM junto con cinasas asociadas a receptor, lo que facilita la fosforilación de los ITAM. La fosforilación de los ITAM sirve como un sitio de anclaje para la cinasa Syk, cuya activación da como resultado la activación de sustratos corriente abajo (p. ej., PI3K) . La activación celular conduce a la liberación de mediadores proinflamatorios.

El gen FcyRIIB se expresa en linfocitos B; su dominio extracelular es un 96 % idéntico a FcyRIIA y une complejos de IgG de una manera no distinguible. La presencia de un ITIM en el dominio citoplásmico de FcyRIIB define esta subclase inhibidora de FcyR. Recientemente, se estableció la base molecular de esta inhibición. Cuando se une con un FcyR activador, el ITIM de FcyRIIB se fosforila y atrae el dominio SH2 de la fosfatasa de inositoles 5'-polifosfato (SHIP) , que hidroliza mensajeros fosfoisonitol liberados como consecuencia de la activación de tirosina cinasas mediada por FcyR que contienen ITAM, impidiendo en consecuencia la entrada de Ca++ intracelular. Así, el entrecruzamiento de FcyRIIB amortigua la respuesta activadora frente a la unión de FcyR e inhibe la capacidad de respuesta celular. Por tanto, se anulan la activación de linfocitos B, la proliferación de linfocitos B y la secreción de anticuerpos.

TABLA 1. Receptores para las regiones Fc de isotipos de inmunoglobulina

2.2 Enfermedades de importancia

2.2.1 Cáncer

Una neoplasia, o tumor, es una masa neoplásica que resulta de un crecimiento celular incontrolado anormal que pueden ser benigno o maligno. Los tumores benignos generalmente permanecen localizados. Los tumores malignos se denominan colectivamente cánceres. El término "maligno" generalmente significa que el tumor puede invadir y destruir estructuras del organismo vecinas y diseminarse a lugares alejados para provocar la muerte (para... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo de IgG aislado o uno de sus fragmentos que unen específicamente el dominio extracelular de FcyRIIB expresado de forma endógena en una célula humana con una afinidad al menos 10 veces mayor que con la que dicho anticuerpo o fragmento unen FcyRIIA expresado de forma endógena en una célula humana, en el que dicha unión es a través del dominio variable.

2. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1, en el que la región variable de dicho anticuerpo bloquea la unión de un Fc de Ig a FcyRIIB.

3. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 2, que potencia la activación de linfocitos B, la proliferación celular de linfocitos B, la entrada de calcio intracelular, la actividad de una molécula de señalización corriente abajo en la ruta de transducción de señales de FcyRIIB o una respuesta celular dependiente de anticuerpos.

4. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo activa la señalización mediada por el receptor de linfocitos B o inhibe la activación de mastocitos mediada por Fc£R1.

5. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho anticuerpo compite por la unión a FcyRIIB con el anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma 2B6, con número de acceso de ATCC PTA-4591, o con el anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma 3H7, con número de acceso de ATCC PTA-4592.

6. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo monocatenario o un anticuerpo humano.

7. El fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dicho fragmento es un fragmento F (ab') 2 o un fragmento F (ab) .

8. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que dicho anticuerpo o fragmento une el dominio extracelular de FcyRIIB con una afinidad al menos 100 veces mayor que con la que dicho dominio variable une FcyRIIA.

9. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo o fragmento biespecífico que comprende una primera pareja de cadena pesada-cadena ligera que une específicamente FcyRIIB con una afinidad mayor que con la que dicha pareja de cadena pesada-cadena ligera une FcyRIIA, y una segunda pareja de cadena pesada-cadena ligera que une un antígeno tumoral.

10. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicho anticuerpo o fragmento se une de manera operable a un agente terapéutico, una citotoxina o un polipéptido heterólogo, en el que dicho polipéptido heterólogo es un anticuerpo que une inmunoespecíficamente un receptor de superficie celular.

11. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 10, en el que dicho receptor de superficie celular es un antígeno tumoral.

12. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y 8-11 que comprende una región Fc, que comprende además al menos una modificación en la región Fc que modifica la afinidad de la región Fc de dicho anticuerpo por un FcyR.

13. El anticuerpo de la reivindicación 12, en el que dicha región Fc une FcyRIIIA con una afinidad mayor que con la que un anticuerpo comparable que comprende una región Fc natural une FcyRIIIA.

14. El uso de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de la reivindicación 3 en la preparación de un medicamento para tratar el cáncer en un paciente.

15. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 3 para su uso en el tratamiento del cáncer.

16. El uso de la reivindicación 14 o el anticuerpo o fragmento de la reivindicación 15 para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicho medicamento o tratamiento es para su uso en combinación con un segundo anticuerpo que une específicamente un antígeno canceroso y es citotóxico, en el que dicho cáncer se caracteriza por dicho antígeno canceroso.

17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16, el anticuerpo o fragmento de la reivindicación 16, para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicho antígeno canceroso es MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, N-acetilglucosaminiltransferasa, p15, beta-catenina, MUM-1, CDK4, HER-2/neu, papilomavirus-E6 humano, papilomavirus-E7 humano o MUC-1.

18. El uso de la reivindicación 14 o el anticuerpo o fragmento de la reivindicación 15 para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicho medicamento o tratamiento es para su uso en combinación con un segundo anticuerpo que no media su efecto terapéutico mediante muerte celular.

19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18, el anticuerpo o fragmento de la reivindicación 18 para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la reivindicación 18, en el que dicho segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-Fas.

20. Uso del anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1 y una composición de vacuna, estando dicho anticuerpo o

uno de sus fragmentos en una cantidad eficaz para potenciar la respuesta inmunitaria de un sujeto frente a dicha composición de vacuna en la preparación de una composición farmacéutica para potenciar una respuesta inmunitaria frente a dicha composición de vacuna en dicho sujeto.

21. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1 para su uso en la potenciación de la respuesta inmunitaria frente a una composición de vacuna, en el que dicho uso es en combinación con dicha composición de vacuna.

22. Una composición farmacéutica que comprende:

(i) una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13; y

(ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

23. La composición farmacéutica de la reivindicación 22, en la que dicho anticuerpo o fragmento potencia la activación de linfocitos B, la proliferación celular de linfocitos B, la entrada de calcio intracelular, la actividad de una molécula de señalización corriente abajo en la ruta de transducción de señales de FcyRIIB o una respuesta celular dependiente de anticuerpos, y en la que dicha composición comprende adicionalmente un anticuerpo citotóxico que une específicamente un antígeno canceroso.

FIG. 1A

FIG. 1B

FIG. 2

FIG. 3

FIG. 4

FIG. 5

FIG. 6

FIG. 8

FIG. 9A

FIG. 9B

Figura 10. Se incubaron células CHO que expresaban huFcyRIIB con los anticuerpos anti CD32B, 2B6 o 3H7. Las células se lavaron y se añadieron 9 μg/ml de IgG humana agregada a las células en hielo. Las IgG humanas agregadas se detectaron con anti-IgG humana conjugado con FITC de cabra. Las muestras se analizaron por FACS…..control de isotipo + anti-huIgG-FITC de cabra, ------------ control deisotipo + IgG humana agregada + anti-IgG humana-FITC de cabra, ------------- anticuerpo anti-CD32B + IgG humana agregada + anti-IgGhumana-FITC de cabra. La cantidad de cada anticuerpo unido a receptores de las células también se detectó (incluido) en un conjunto de muestras separado usando anticuerpo anti-ratón conjugado con PE de cabra.

Figura 12. Liberación de B-hexosaminidasa inducida porfragmento F (ab) 2 de anti-ratón de cabra (GAM F (ab) 2) en células RBL-2H3 que expresan huFcyRIIB. Las células se estimularon con diversas concentraciones de GAM F (ab) 2 (0, 03 μg/ml a 30 μg/ml) tras la sensibilización con IgE de ratón (0, 01 μg/ml) e IgG1 o con el grupo de anticuerpos 2B6 purificado (3 μg/ml) . Después de 1 hora a 37 ºC se recogió el sobrenadante y las células se lisaron. La actividad º-hexosaminidasa liberada en el sobrenadante y dentro de las células se determinó mediante un ensayo colorimétrico usando pnitrofenil N-acetil--D-glucosamínido. La actividad º-hexosaminidasa liberada se expresó como un porcentaje de la actividad liberada con relación a la actividad total.

Figura N.º 4. Las líneas celulares de carcinoma ovárico y de mama expresan Her2neu a niveles variables. Tinción de A) IGROV-1 ováricas con ch4D5 purificado, B) OVCAR-8 ováricas con anticuerpo 4D5 purificado y C) células SKBR-3 de cáncer de mama con ch4D5 purificado seguido de anti-humano conjugado con ficoeritrina (PE) de cabra. La IgG1 de control de isotipo pertinente se indica a la izquierda de la tinción con anticuerpo anti-Her2neu.

Figura 6. Los monocitos elutriados expresan todos los FcyR: A) MDM obtenido del donante 1, B) del donante 2, se propagaron en suero humano o suero humano y GMCSF y C) monocitos descongelados y teñidos inmediatamente. Los macrófagos derivados de monocitos se tiñeron con anticuerpos específicos para receptor FcyR humano, (sección C.4) . El área oscura de cada gráfica representa la tinción de base. El área clara dentro de cada panel representa la tinción con anticuerpos anti-FcyR humano específicos.

FIGURA N.º 7 A) B)

Figura N.º 7. Ch4D5 media la ADCC eficaz con líneas celulares de cáncer ovárico y de mama usando PBMC. La lisis específica sustraída de la lisis independiente de anticuerpos se muestra para A) línea celular tumoral de ovario, IGROV-1 a una proporción efector:diana de 75:1 y para B) línea celular tumoral de mama, SKBR-3 a una proporción efector:diana de 50:1 con diferente concentración de ch4D5, como se indica.

FIGURA N.º 5

Figura N.º 5. La tinción histoquímica de ascitis ovárica humana muestra células tumorales y otras células inflamatorias. A) Tinción H y E en ascitis de una paciente con tumor ovárico. Pueden identificarse tres células neoplásicas por el tamaño y forma irregulares, citoplasma disperso y núcleos de densidad irregular. B) Tinción de Giemsa de ascitis no procesada de una paciente con tumor seroso del ovario muestra dos células mesoteliales situadas juntas indicadas con flechas cortas. También se muestra un conjunto de cinco células epiteliales malignas indicado por la flecha larga. Los eritrocitos son visibles en el fondo. C) Tinción de Giemsa de otra paciente con tumor seroso del ovario que indica un conjunto de células compuesto por células mesoteliales, linfocitos y células epiteliales neoplásicas (flecha) .