Composiciones y métodos para anticuerpos dirigidos contra la proteína C5 del complemento.

Un anticuerpo monoclonal aislado dirigido contra la proteína C5 humana,

o un fragmento del mismo que se enlaza al antígeno, que comprende

(i) una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1; una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 2; y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3; y

(ii) una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 5; y una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 6, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo que se enlaza al antígeno se enlaza a la proteína C5 humana con una KD de 10-10 M o menos de acuerdo a lo medido por resonancia de plasmón superficial.

Composiciones y métodos para anticuerpos dirigidos contra la proteína C5 del complemento

1. Introducción

La presente invención se refiere a anticuerpos que se dirigen a la proteína C5 del complemento, y a composiciones y métodos para el uso de los mismos.

2. Antecedentes de la invención

El papel normal del complemento, que es parte del sistema inmunitario innato, está en la defensa del huésped. El complemento defiende contra una infección bacteriana, vincula la inmunidad adaptativa e innata, y dispone los complejos inmunes y los productos de una lesión inflamatoria.

Las funciones de defensa se llevan a cabo mediante productos biológicamente activos generados en el transcurso de la activación del complemento, que opsonizan a los agentes infecciosos, promueven la inflamación, o lisan los objetivos susceptibles (Marzari y colaboradores, Eur. J. Immunol. 32: 2773 - 2782 (2002) ) . El sistema del complemento consiste en aproximadamente 25 - 30 proteínas de plasma que juegan un papel en el sistema inmune. La cascada del complemento se activa mediante al menos tres rutas principales. La ruta clásica típicamente es activada por complejos inmunes, la ruta alternativa puede ser activada por las superficies celulares no protegidas, y la ruta de la lectina que se enlaza a manosa (LEM) es iniciada por el enlace de LEM a los carbohidratos de la superficie de la célula (Trendelenburg, Swiss Med WkIy 137: 413 - 417 (2007) ) .

Las tres rutas conducen a la escisión de C5 mediante la C5 convertasa. EI resultado de esta escisión es la liberación de un fragmento C5a, una potente molécula inflamatoria, y C5b, que inicia al complejo de ataque de la membrana (CAM) . Los productos del complemento, una vez liberados, no diferencian entre los objetivos extraños y los propios, y, si no se regulan estrechamente, con frecuencia provocan un daño extenso de las células y tejidos espectadores en condiciones clínicas asociadas con la activación del complemento sin restricciones (Marzari y colaboradores, 2002) .

C5 se expresa intracelularmente como un solo péptido pro-C5 de 1.676 aminoácidos, que consiste en una secuencia señal de 18 residuos y una secuencia enlazadora rica en Arg (RPRR) situada entre la cadena β N-terminal madura y la cadena α C-terminal. EI C5 maduro tiene un peso molecular de aproximadamente 190 kDa, y consiste en dos cadenas de polipéptido (α, de 115 kDa, y β, de 75 kDa) , que están conectadas mediante enlaces de disulfuro. La C5 convertasa escinde a C5 entre los residuos 74 y 75 de la cadena alfa para liberar al péptido C5a de 74 aminoácidos y al fragmento C5b que es posteriormente incorporado en el complejo de ataque de la membrana (CAM) .

La degeneración macular es una condición médica que se encuentra predominantemente en la ancianidad, en donde el centro del revestimiento interno del ojo, conocido como el área de la mácula de la retina, sufre adelgazamiento, atrofia, y en algunos casos, hemorragia. Esto puede dar como resultado la pérdida de la visión central, lo cual implica una incapacidad para ver los detalles finos, para leer, o para reconocer las caras. La patogénesis de la nueva formación de vasos coroideos es pobremente entendida, pero se piensa que son importantes factores tales como inflamación, isquemia, y la producción local de factores angiogénicos.

A pesar de las opciones de tratamiento actuales para tratar las enfermedades y trastornos asociados con las rutas de componentes clásicos o alternativos, en particular DME, sigue existiendo la necesidad por encontrar agentes específicos que conduzcan a tratamientos que sean efectivos y bien tolerados.

La solicitud estadounidense de patente No. 2006/0115476 A1 (Tedesco y Marzari) describe anticuerpos recombinantes de origen humano específicos para el componente C5 del complemento activado. Los anticuerpos se caracterizan por su capacidad para inhibir la conversión de la cadena alfa de C5 en C5a y C5b. La solicitud estadounidense de patente No.2006/0115476 A1 divulga además secuencias de nucleótidos que codifican para tales anticuerpos y para uso terapéutico tanto de secuencias de polipéptidos como de nucleótidos, en particular para la terapia de enfermedades que implican daño tisular derivado de activación incontrolada del sistema del complemento.

3. Resumen de la invención Las realizaciones de la invención se definen mediante las reivindicaciones.

La presente invención proporciona moléculas aisladas que se enlazan a la C5 del complemento (por ejemplo, anticuerpos que se enlazan a C5 o fragmentos de los mismos que se enlazan con el antígeno) , composiciones farmacéuticas que comprenden tales moléculas, métodos para la elaboración de tales moléculas y composiciones, y métodos de uso de las mismas.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno que se enlazan específicamente a una proteína C5, en donde dicho anticuerpo tiene una constante de afinidad (KA) de al menos 1010 M-1, o 1011 M-1.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan específicamente a una proteína C5, y que inhiben la ruta completa alternativa, como se mide mediante un ensayo hemolítico in vitro, con un intervalo de IC50 de aproximadamente 20 pM hasta aproximadamente 200 pM.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan específicamente a una proteína C5, y compiten en forma cruzada con un anticuerpo descrito en la Tabla 1 que se presenta más adelante. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan al mismo epítopo de la proteína C5 que un anticuerpo descrito en la Tabla 1 más adelante.

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales aislados que se enlazan específicamente a una proteína C5. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos o humanizados aislados que se enlazan específicamente a esa proteína. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención son anticuerpos quiméricos aislados que se enlazan específicamente a una proteína C5. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden una región constante de cadena pesada humana y una región constante de cadena ligera humana.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan específicamente a una proteína C5, en donde dichos anticuerpos son anticuerpos de una sola cadena. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención son fragmentos Fab. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención son scFv.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan específicamente tanto a C5 humana como a C5 de cinomólogo. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención son un isotipo de IgG.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, los cuales comprenden una estructura en la cual se han sustituido aminoácidos en la estructura del anticuerpo a partir de las respectivas secuencias de la línea germinal de VH o VL humana.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan específicamente a una proteína C5, en donde dichos anticuerpos comprenden al menos una secuencia que determina la complementariedad (CDR) que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, 95%, 97%, 98%, o al menos el 99% con las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 49, 50, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 77, 78, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 120, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 209, 226, 235, 236, 237, 238, 239, o 240.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan específicamente a una proteína C5, en donde dichos anticuerpos comprenden al menos una secuencia de la CDR de cadena pesada que es idéntica a las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 17, 18, 19, 33, 34, 35, 49, 61, 62, 63, 77, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 131, 133, 145,... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal aislado dirigido contra la proteína C5 humana, o un fragmento del mismo que se enlaza al antígeno, que comprende

(i) una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1; una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 2; y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3; y

(ii) una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 5; y una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 6, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo que se enlaza al antígeno se enlaza a la proteína C5 humana con una KD de 10-10 M o menos de acuerdo a lo medido por resonancia de plasmón superficial.

2. Un anticuerpo monoclonal aislado, o fragmento que se enlaza al antígeno como se reivindica en la reivindicación 1 que comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; y una región variable de cadena ligera que tiene al menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.

3. Un anticuerpo monoclonal aislado, o fragmento que se enlaza al antígeno como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:

8.

4. Un anticuerpo monoclonal aislado, o fragmento que se enlaza al antígeno como se reivindica en cualquier reivindicación anterior que comprende una cadena pesada que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9; y una cadena ligera que tiene al menos 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10.

5. Un anticuerpo monoclonal aislado, o fragmento que se enlaza al antígeno como se reivindica en la reivindicación 4 que comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.

6. El anticuerpo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que inhibe la ruta alternativa del complemento con una IC50 d.

20. 200 pM como la medida por el ensayo hemolítico in vitro cuando se utiliza suero agotado en C5 humana que se reconstituye con C5 humana 100 pM.

7. El anticuerpo o un fragmento que se enlaza al antígeno como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humano.

8. El anticuerpo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho anticuerpo es un isotipo de IgG.

9. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento que se enlaza al antígeno tal como se reivindica en cualquier reivindicación anterior y un portador farmacéuticamente aceptable.

10. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o fragmento que se enlaza al antígeno como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

11. El ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 10, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7, o una región variable de cadena ligera que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8.

12. El ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 11 en donde la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 11, y la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 12.

13. Un vector que comprende el ácido nucleico como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.

14. Una célula huésped aislada que comprende segmentos de ADN recombinantes que codifican una cadena pesada y una cadena ligera del anticuerpo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8; en

donde dichos segmentos de ADN están operativamente enlazados a un promotor, y son capaces de ser expresados en dicha célula huésped.

15. El anticuerpo o fragmento que se enlaza al antígeno como se reivindica en una cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 8, o la composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 9, para uso como un 5 medicamento.

16. El anticuerpo o fragmento que se enlaza al antígeno como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 9, para uso en el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad, asma, artritis, enfermedad coronaria autoinmune, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, lesiones por isquemia-reperfusión, síndrome de Barraquer

Simons, lupus sistémico, lupus eritematoso, psoriasis, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, glomerulonefritis, hemoglobinuria nocturna paroxismal (PNH) , o MPGN II.

17. El anticuerpo o fragmento que se enlaza al antígeno como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 9 para uso en un método para reducir la disfunción de los sistemas inmunológico y hemostático asociada con circulación extracorpórea mediante la administración del anticuerpo o fragmento del mismo que se enlaza al antígeno o la composición farmacéutica a un sujeto que requiera del mismo.