Anticuerpos para determinar el fragmento de protrombina F2/F1+2 en un inmunoensayo homogéneo.

Inmunocomplejo aislado que contiene un péptido el cual comprende al menos el fragmento de protrombina F2 completo

, en cuyo terminal carboxilo está enlazado un fragmento de anticuerpo con especificidad para el neoepítopo carboxiterminal del fragmento de protrombina F2/F1+2, el cual contiene al menos los cuatro aminoácidos carboxiterminales Ile-Glu-Gly-Arg-OH, en cuyo caso el inmunocomplejo está acoplado a una proteína soporte inmunoestimulante.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E09011791.

Solicitante: SIEMENS HEALTHCARE DIAGNOSTICS PRODUCTS GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: EMIL-VON-BEHRING-STRASSE 76 35041 MARBURG ALEMANIA.

Inventor/es: ALTHAUS, HARALD, FISCHER,BODO, TEIGELKAMP,STEFAN,DR, EHM,Matthias, BARTEN,ROLAND.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/36 (contra factores de coagulación sanguínea)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/74 (Trombina)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/86 (en los que interviene el tiempo de coagulación de la sangre)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/42 (contra inmunoglobulinas (anticuerpos anti-idiotípicos))

PDF original: ES-2507083_T3.pdf

 

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Anticuerpos para determinar el fragmento de protrombina F2/F1+2 en un inmunoensayo homogéneo.

Fragmento de la descripción:

Anticuerpos para determinar el fragmento de protrombina F2/F1+2 en un inmunoensayo homogéneo La presente invención se encuentra en el campo del diagnóstico de coagulación y se refiere a anticuerpos que se enlazan específicamente a un complejo de F2/F1+2 y a un ligando específico F2/F1+2, así como a su preparación y a su uso en métodos para determinar F2/F1+2.

Para la evaluación clínica del estado del sistema de coagulación de la sangre de un paciente se encuentra disponible un gran número de parámetros relevantes para el diagnóstico. Principalmente, la detección cuantitativa de los llamados marcadores de activación de la coagulación hace imposible evaluar el proceso de coagulación o de fibrinólisis. La determinación del fragmento de protrombina F2/F1+2 en una muestra de un paciente hace posible la detección o el descarte de una formación de trombina incrementada in vivo y se emplea por ejemplo para revelar la formación de trombina intravascular en el caso de una coagulopatía por consumo, en tromboembolias venosas agudas o en el caso de oclusiones arteriales de vasos (infarto de miocardio, infarto cerebral) o para monitorear terapias anticoagulantes.

Protrombina es la proenzima de trombina, la enzima central de la cascada de coagulación de la sangre. La proteína protrombina tiene una estructura modular y consiste en una porción F1+2 N-terminal y una porción de trombina Cterminal. La protrombina se disocia mediante la actividad proteolítica del factor Xa de modo que por cada molécula de protrombina (70 kD) se genera una molécula de trombina (30 kD) y se libera un fragmento de protrombina F1+2 (35-37 kD) . Mediante la disociación autocatalítica de protrombina por trombina puede llegarse además a la disociación de los fragmentos F1 (23 kDa) y F2 (14 kDa) . Puesto que la trombina no existe en forma libre en la sangre pero está directamente enlazada a inhibidores y la fibrina, el alcance de la formación de la trombina tiene que comprenderse indirectamente, por ejemplo determinando los marcadores de activación F1+2 y/o F2. Una posibilidad para detectar o descartar una formación incrementada de trombina in vivo es, por consiguiente, la determinación de la concentración de F2/F1+2 en el plasma.

En general, en los ensayos de F2/F1+2 surge la dificultad de que la protrombina se presenta en la muestra en un exceso molar de 1000 a 10000 veces en comparación con F2/F1+2. La detección inmunológica de F2/F1+2 en presencia de protrombina se ve obstaculizada por el hecho de que los fragmentos F2/F1+2 liberados de protrombina tienen, en comparación con la protrombina intacta, no disociada, solamente un epítopo antígeno único específico para F2/F1+2, concretamente el terminal carboxilo del péptido F2/F1+2 (neoepitopo) producido mediante la disociación de trombina. Sólo los anticuerpos dirigidos contra la región carboxi-terminal del péptido F2/F1+2 son capaces de enlazarse específicamente a los fragmentos de protrombina F2/F1+2 sin mostrar al mismo tiempo una especificidad por la protrombina intacta. Todos los otros determinantes antigénicos del fragmento F2/F1+2 son asimismo específicos para protrombina intacta.

La preparación de anticuerpos F2/F1+2 específicos que no se enlazan a la protrombina se describe, por ejemplo, en la EP 303 983 A2 (Pelzer et al.) , en US 5, 830, 681 (Hursting et al.) o en US 2003/0219845 A1 (Ruiz et al.) . Para la especificidad de los anticuerpos anti-F2/F1+2 es importante que se enlacen a un epítopo que contiene al menos los cuatro aminoácidos con terminal carboxilo de los fragmentos 2/F1+2 (Ile-Glu-Gly-Arg-OH) . Puesto que por lo regular para determinar la concentración de F2/F1+2 se emplean inmunoensayos de sándwich, se necesitan dos anticuerpos anti-F2/F1+2. En EP 1 541 676 A1 (Teigelkamp et al.) se describen anticuerpos que se enlazan a un epítopo sobre la mitad N-terminal del fragmento F2 y con esto también a la protrombina intacta, aunque son particularmente adecuados para usar como anticuerpos secundarios en combinación con anticuerpos primarios específicos para neoepítopo en un inmunoensayo de sándwich.

Los anticuerpos son adecuados para determinar la concentración de F2/F1+2 en muestras de plasma en inmunoensayos heterogéneos, preferiblemente en forma de un método ELISA de sándwich. Para este propósito los anticuerpos neoepítopo-específicos para F2/F1+2 ("anticuerpos primarios") se acoplan a una fase sólida y se incuban con la muestra de modo que los péptidos de F2/F1+2 son capaces de enlazarse a los anticuerpos inmovilizados. Mediante un paso de lavado se retiran las proteínas no enlazadas, principalmente protrombina, antes de aplicar el segundo anticuerpo ("anticuerpo secundario") que se enlaza a F2/F1+2 y a protrombina adicionando una solución de anticuerpos. Éste segundo anticuerpo ordinariamente se asocia con un componente generador de señal, que permite cuantificar la concentración de F2/F1+2.

Sin embargo, establecer un inmunoensayo de sándwich homogéneo sin pasos de lavado o de separación es solamente posible de una manera restringida a partir del estado de la técnica de los anticuerpos monoclonales conocidos, puesto que el anticuerpo secundario que se enlaza a F2/F1+2 y a protrombina en la estructura del ensayo homogéneo se enlaza en gran parte por la protrombina contenida en la muestra y de esta manera ya no se encuentra disponible para la formación de sándwich con el analito F2/F1+2, el cual es indispensable para generación de señal.

Por lo tanto, la presente invención se basó en el objetivo de proporcionar medios que hicieran posible determinar F2/F1+2 en muestras que contuvieran protrombina en exceso, específicamente en un ensayo de enlazamiento homogéneo.

El objetivo se logró proporcionando medios y procesos de acuerdo con la invención descritos en las reivindicaciones.

Principalmente el objetivo se logró proporcionando un anticuerpo monoclonal que se enlaza de modo específico a un complejo inmune que contiene un fragmento de protrombina F2/F1+2, al cual está enlazado un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo con especificidad por el neoepítopo carboxi-terminal del fragmento de protrombina F2/F1+2 y en cuyo caso el anticuerpo, sin embargo, no se enlaza al fragmento de protrombina F1+2 o F2 sólo y no se enlaza al anticuerpo o el fragmento de anticuerpo con especificidad por el neoepítopo carboxiterminal del fragmento de protrombina F2/F1+2 sólo.

Teóricamente se conocen anticuerpos con especificidad por inmunocomplejos que se componen de un analito al cual se enlaza un ligando específico para el analito, por ejemplo un anticuerpo primario o un fragmento de anticuerpo primario, por ejemplo de EP 264 219 A2, EP 475 784 A1, WO 85/04422 A1 o WO 87/07147. Sin embargo, en relación a la presente invención, se estableció de manera sorprendente que a fin de obtener un anticuerpo de acuerdo con la invención con especificidad para un inmunocomplejo de ligando de fragmento de protrombina F2/F1+2, tiene que usarse un inmunocomplejo como antígeno inmunizante que contiene un péptido, que comprende al menos el fragmento de protrombina completo F2 al cual se enlaza un fragmento de anticuerpo con especificidad por el neoepítopo carboxiterminal del fragmento de protrombina F2/F1+2. Con inmunocomplejos que solamente contenían un fragmento del fragmento de protrombina F2, así como con inmunocomplejos que solamente contenían un anticuerpo completo con especificidad para el neoepítopo del fragmento de protrombina F2/F1+2, no podían generarse anticuerpos con especificidad para el inmunocomplejo.

Es objeto de la presente invención un inmunocomplejo aislado, purificado, que contiene un péptido que comprende al menos el fragmento de protrombina F2 completo a cuyo terminal carboxi se enlaza un fragmento de anticuerpo con especificidad... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Inmunocomplejo aislado que contiene un péptido el cual comprende al menos el fragmento de protrombina F2 completo, en cuyo terminal carboxilo está enlazado un fragmento de anticuerpo con especificidad para el neoepítopo carboxiterminal del fragmento de protrombina F2/F1+2, el cual contiene al menos los cuatro aminoácidos carboxiterminales Ile-Glu-Gly-Arg-OH, en cuyo caso el inmunocomplejo está acoplado a una proteína soporte inmunoestimulante.

2. Inmunocomplejo de acuerdo con la reivindicación 1, en cuyo caso el fragmento de anticuerpo enlazado es un fragmento Fab, Fabâ?, F (abâ?) 2 o Fv.

3. Inmunocomplejo de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en cuyo caso el fragmento de anticuerpo enlazado es un fragmento de un anticuerpo monoclonal que se forma por la línea celular de hibridoma DSM ACC 2911.

4. Inmunocomplejo de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, el cual está acoplado a la proteína soporte inmunoestimulante hemocianina de lapa (Keyhole Limpet Hemocyanin) .

5. Inmunocomplejo de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, el cual está reticulado por medio de un aldehído.

6. Uso de un inmunocomplejo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5 como antígeno de inmunización en un método para producir un anticuerpo monoclonal.

7. Anticuerpo monoclonal caracterizado porque se enlaza a un inmunocomplejo, en cuyo caso el inmunocomplejo contiene un péptido que comprende al menos el fragmento de protrombina F2 completo y a cuyo terminal carboxilo se enlaza un fragmento de anticuerpo con especificidad para el neoepítopo carboxiterminal del fragmento de protrombina F2/F1+2, el cual contiene al menos los cuatro aminoácidos carboxi terminales Ile-Glu-Gly-Arg-OH, en cuyo caso el anticuerpo monoclonal, sin embargo, no se enlaza al fragmento de protrombina F2 solo y no se enlaza al fragmento de anticuerpo con especificidad para el neoepítopo carboxiterminal del fragmento de protrombina F2/F1+2 solo.

8. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 7 caracterizado porque éste se produce por una de las líneas celulares de hibridoma DSM ACC2912, DSM ACC2913 o DSM ACC2914.

9. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 y 8 caracterizado porque se asocia con un componente de un sistema generador de señal.

10. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 a 9 caracterizado porque se asocia con una fase sólida.

11. Uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 a 10 o de un fragmento del mismo, el cual se enlaza a un inmunocomplejo, en cuyo caso el inmunocomplejo contiene un péptido que comprende al menos el fragmento de protrombina F2 completo y en cuyo terminal carboxilo está enlazado un fragmento del anticuerpo con especificidad para el neoepítopo carboxiterminal del fragmento de protrombina F2/F1+2, el cual contiene los cuatro aminoácidos carboxiterminales Ile-Glu-Gly-Arg-OH, en cuyo caso el anticuerpo monoclonal, sin embargo, no se enlaza al fragmento de protrombina F2 solo y no se enlaza al fragmento de anticuerpo con especificidad para el neoepítopo carboxiterminal del fragmento de protrombina F2/F1+2 solo, en un método in vitro para detección cuantitativa o cualitativa de F2/F1+2.

12. Línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 7.

13. Línea celular de hibridoma de acuerdo con la reivindicación 12, la cual está depositada en la DSMZ bajo el número de acceso DSM ACC2912, DSM ACC2913 o DSM ACC2914.

14. Reactivo que contiene un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 a 10 o un fragmento del mismo, el cual se enlaza a un inmunocomplejo, en cuyo caso el inmunocomplejo contiene un péptido que comprende al menos el fragmento de protrombina F2 completo y en cuyo terminal carboxilo está enlazado un fragmento de anticuerpo con especificidad para el neoepítopo carboxiterminal del fragmento de protrombina F2/F1+2, el cual contiene al menos los cuatro aminoácidos carboxiterminales Ile-Glu-Gly-Arg-OH, en cuyo caso el anticuerpo monoclonal, sin embargo, no se enlaza al fragmento de protrombina F2 solo y no se enlaza al fragmento de anticuerpo con especificidad para el neoepítopo carboxiterminal del fragmento de protrombina F2/F1+2 solo.

15. Kit de ensayo que contiene un reactivo de acuerdo con la reivindicación 14.

16. Método para determinar el fragmento de protrombina F2/F1+2 en una muestra, en cuyo caso la muestra se pone en contacto con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo con especificidad para el neoepítopo carboxiterminal del fragmento de protrombina F2/F1+2 para formar un inmunocomplejo con el fragmento de protrombina F2/F1+2 contenido en la muestra, caracterizado porque la muestra adicionalmente se pone en contacto con un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7.