Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de unión a antígeno del mismo,

que se une específicamente y neutraliza la toxina A de Clostridium difficile (C. difficile), en el que el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, comprende: (a) una región de la cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 7 a 9 y una región de la cadena ligera variable que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 16 a 18; (b) una región de la cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 10 a 12 y una región de la cadena ligera variable que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 19 a 21; o (c) una región de la cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 13 a 15 y una región de la cadena ligera variable que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 22 a 24.

Antecedentes de la invención

Clostridium difficile (C. difficile) es una bacteria gram-negativa que produce enfermedad gastrointestinal en seres humanos. C. difficile es la causa más común de diarrea infecciosa en pacientes hospitalizados y es una de las infecciones nosocomiales más comunes en conjunto (Kelly y col., New Eng. J. Med., 330:257-62, 1994). En realidad, la enfermedad asociada a este patógeno puede aquejar a hasta tres millones de pacientes hospitalizados al año en Estados Unidos (McFarland y col., New Eng. J. Med., 320:204-10, 1989; Johnson y col., Lancet, 336:97-100, 1990).

El tratamiento con antibióticos tales como ampicilina, amoxicilina, cefalosporinas y clindamicina que altera la flora intestinal normal puede permitir la colonización del intestino con C. difficile y conduce a enfermedad por C. difficile (Kelly y Lamont, Annu. Rev. Med., 49:375-90, 1998). La aparición de enfermedad por C. difficile se produce normalmente cuatro a nueve días después de empezar el tratamiento con antibiótico, pero también puede producirse después de retirar la terapia con antibiótico. C. difficile puede producir síntomas que oscilan de diarrea y colitis leve a grave que incluye colitis pseudomembranosa (PMC), una forma grave de colitis caracterizada por dolor abdominal, diarrea líquida y enfermedad sistémica (por ejemplo, fiebre, náuseas). La enfermedad recurrente puede producirse en hasta el 20 % de los pacientes tratados de un primer episodio enfermedad, y aquellos que recayeron tienen un mayor riesgo de recaídas adicionales (Kelly y Lamont, Annu. Rev. Med., 49:375-90, 1998).

Se cree que la enfermedad por C. difficile es producida por las acciones de dos exotoxinas, la toxina A y la toxina B, sobre el epitelio intestinal. Ambas toxinas son proteínas de alto peso molecular (280-300 kDa) que catalizan la modificación covalente de proteínas Rho, proteínas pequeñas de unión a GTP que participan en la polimerización de actina, en células huésped. La modificación de proteínas Rho por las toxinas las inactiva, conduciendo a despolimerización de filamentos de actina y muerte celular. Ambas toxinas son mortales para ratones cuando se inyectan parenteralmente (Kelly y Lamont, Annu. Rev. Med., 49:375-90, 1998).

La enfermedad por C. difficile puede diagnosticarse por ensayos que detectan la presencia o actividad de toxina A o toxina B en muestras de heces, por ejemplo, inmunoensayos enzimáticos. Los ensayos de citotoxinas pueden usarse para detectar la actividad de la toxina. Para realizar un ensayo de citotoxina, las heces se filtran para eliminar bacterias y se determinan los efectos de toxinas citopáticas sobre las células cultivadas (Merz y col., J. Clin. Microbiol., 32:1142-47, 1994).

El tratamiento de C. difficile se complica por el hecho de que los antibióticos desencadenan enfermedad asociada a

C. difficile. Sin embargo, los antibióticos son actualmente la opción de tratamiento primaria. Frecuentemente se usan antibióticos que es menos probable que produzcan enfermedad asociada a C. difficile tal como vancomicina y metronidazol. La resistencia a vancomicina que se desarrolla en otros microorganismos es un motivo de preocupación en el uso de este antibiótico para el tratamiento, ya que es el único tratamiento eficaz para infección por otros microorganismos (Gerding, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 250:127-39, 2000). También se usan enfoques probióticos en los que a un sujeto se le administran microorganismos no patógenos que supuestamente compiten por nichos con las bacterias patógenas. Por ejemplo, se ha informado del tratamiento con una combinación de vancomicina y Saccharomyces boulardii (McFarland y col., JAMA., 271(24):1913-8, 1994. Errata en: JAMA, 272(7):518, 1994).

Se han desarrollado vacunas que protegen a los animales de la exposición mortal en modelos infecciosos de enfermedad (Torres y col., Infect. Immun. 63(12):4619-27,1995). Además, se ha mostrado que los anticuerpos policlonales protegen a los hámsteres de la enfermedad cuando se administran mediante inyección o la comida (Giannasca y col., Infect. Immun. 67(2):527-38, 1999; Kink y Williams, Infect. Immun., 66(5):2018-25, 1998). Se han aislado anticuerpos monoclonales murinos que se unen a toxinas de C. difficile y neutralizan sus actividades in vivo e in vitro (Corthier y col., Infect. Immun., 59(3):1192-5, 1991). Hay algunos informes de que los anticuerpos policlonales humanos que contienen anticuerpos neutralizantes de toxina pueden prevenir la recaída por C. difficile (Salcedo y col., Gut., 41(3):366-70, 1997). La respuesta de anticuerpos contra la toxina A ha guardado relación con la evolución de la enfermedad, que indica la eficacia de respuestas humorales en el control de la infección. Los individuos con respuestas robustas de ELISA a la toxina A tuvieron enfermedad menos grave en comparación con individuos con bajos niveles de anticuerpo para la toxina A (Kyne y col., Lancet, 357(9251):189-93, 2001).

La función individual de la toxina A y la toxina B en la patogénesis de enfermedades y la función de anticuerpos antitoxina en la protección de enfermedad por C. difficile son controvertidas y pueden depender del huésped. En seres humanos, la respuesta de anticuerpos anti-toxina A ha guardado relación con la evolución de la enfermedad, sugiriendo un requisito para la respuesta de anti-toxina A para la protección. Esta observación es a diferencia de informes de organismos de C. difficile causantes de enfermedad que sólo expresan la toxina B, implicando que la toxina B puede contribuir a una enfermedad en seres humanos. Estas cepas negativas para toxina A también pueden producir enfermedad en hámsteres (Sambol y col., J. Infect. Dis., 183(12):1760-6, 2001).

Kink y col. (Infection and Immunity, 1998, vol. 66, nº 5: 2018-2025) examinaron la función de la toxina A y la toxina B de C. difficile en patogénesis y la capacidad de anticuerpos aviares administrados por vía oral contra epítopes recombinantes de toxina A y toxina B para tratar enfermedad asociada a C. difficile (CDAD).

Corthier y col. (Infection and Immunity, 1991, vol. 59, nº 3: 1192-1195) describieron el uso de anticuerpos monoclonales contra toxina A de C. difficile para la protección contra colitis pseudomembranosa en ratones gnotobióticos.

Resumen de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la administración de anticuerpos contra la toxina A de C. difficile a un sujeto puede proteger al sujeto de la recaída de enfermedad mediada por C. difficile in vivo. La administración de anticuerpos a una o ambas de la toxina A y la toxina B puede prevenir la enfermedad mediada por C. difficile primaria. Los anticuerpos de alta afinidad contra toxinas de C. difficile pueden producirse, por ejemplo, en ratones tales como ratones transgénicos que expresan segmentos del gen de inmunoglobulina humana. Estos anticuerpos pueden neutralizar la citotoxicidad de toxinas in vitro y neutralizar la enterotoxicidad de toxinas in vivo. Los anticuerpos que reconocen la toxina A y/o la toxina B pueden inhibir y proteger de la enfermedad in vivo.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente y neutraliza la toxina A de Clostridium difficile (C. difficile), en el que el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende:

(a) una región de la cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 7 a 9 y una región de la cadena ligera variable que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 16 a 18;

(b) una región de la cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 10 a 12 y una región de la cadena ligera variable que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 19 a 21; o

(c) una región de la cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 13 a 15 y una región de la cadena ligera variable que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 22 a 24.

Los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos neutralizan la toxina A in vitro, inhiben la unión de toxina A a células de mamífero e/o inhiben enfermedad mediada por C. difficile in vivo.

En diversas realizaciones, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos tienen una o más de las siguientes características: cuando se administran a un ratón, protegen al ratón de la administración de una toxina de

1. Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente y neutraliza la toxina A de Clostridium difficile (C. difficile), en el que el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, comprende:

(a) una región de la cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 7 a 9 y una región de la cadena ligera variable que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 16 a 18;

(b) una región de la cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 10 a 12 y una región de la cadena ligera variable que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 19 a 21; o

(c) una región de la cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 13 a 15 y una región de la cadena ligera variable que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 22 a 24.

2. El anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo. de la reivindicación 1 en el que las regiones de la cadena pesada variable y de la cadena ligera variable comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID Nº: 1 y 4, SEC ID Nº: 2 y 5 o SEC ID Nº: 3 y 6, respectivamente.

3. El anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 2 en el que las regiones de la cadena pesada variable y de la cadena ligera variable comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID Nº: 1 y 4.

4. El anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.

5. La porción de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la porción de unión a antígeno comprende Fab, Fab'2, ScFv o Fv.

6. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. Una composición terapéutica que comprende:

(a) el anticuerpo monoclonal, o porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano; y

(b) un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a y neutraliza la toxina B de C. difficile.

8. La composición de la reivindicación 7, en la que el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a y neutraliza la toxina B de C. difficile es un anticuerpo monoclonal.

9. La composición de la reivindicación 8 en la que el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a y neutraliza la toxina B de C. difficile comprende una región de la cadena pesada variable que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 62, 64 y 66 y una región de la cadena ligera variable que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 68, 70 y 72.

10. La composición de la reivindicación 9, en la que las regiones de la cadena pesada y de la cadena ligera variable comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID Nº: 54 y 58 o SEC ID Nº: 56 y 60, respectivamente.

11. La composición de la reivindicación 10, en la que las regiones de la cadena pesada variable y de la cadena ligera variable comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID Nº: 54 y 58, respectivamente.

12. La composición de la reivindicación 11 en la que el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 es el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 3.

13. La composición de la reivindicación 8 en la que el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a y neutraliza la toxina B de C. difficile:

(a) compite por la unión a la toxina B con un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, como se define en la reivindicación 10 ó 11; y/o

(b) se une específicamente a la toxina B con una KD inferior a 20 x 10-6 M.

14. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en la que el anticuerpo que se une específicamente a y neutraliza la toxina B de C. difficile es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.

15. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, en la que la porción de unión a antígeno del anticuerpo que se une específicamente a y neutraliza la toxina B de C. difficile comprende Fab, Fab'2, ScFv o Fv.

16. El anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15 para su uso en un procedimiento para tratar el cuerpo humano o animal mediante terapia o en un procedimiento de diagnóstico llevado a cabo en el cuerpo humano o animal.

17. El anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15 para su uso en un procedimiento para tratar enfermedad mediada por C. difficile en un sujeto.

18. El anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, o la composición de la reivindicación 17, en el que el sujeto es humano.

19. El anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, o la composición de la reivindicación 17 ó 18, en el que el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo se administran intravenosamente, intramuscularmente o subcutáneamente al sujeto.

20. El anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo se administran con otro agente terapéutico.

21. El anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 20, en el que el agente terapéutico es un antibiótico, gamma-globulina policlonal, agente probiótico o vacuna de C. difficile.

22. El anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 21, en el que el antibiótico es vancomicina, metronidazol o bacitracina, en el que el agente probiótico es Saccharomyces boulardii o en el que la vacuna de C. difficile es una vacuna de toxoide.

23. El anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 20, en el que el agente terapéutico es un anticuerpo monoclonal, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a la toxina B de

C. difficile.

24. Un kit que comprende:

(a) el anticuerpo monoclonal, o porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y

(b)

(i) una marca;

(ii) un agente terapéutico;

(iii) un agente para acoplar el anticuerpo a una marca o agente terapéutico; o

(iv) un dispositivo para administrar el anticuerpo a un sujeto.

25. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 5 o SEC ID Nº: 6.

26. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 25.

27. Una célula huésped aislada que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 25.