Anticuerpos contra la IL-18R1 y usos de los mismos.

Anticuerpo aislado ligante de IL-18R1 humana y caracterizado por que comprende como las CDR de región variable de cadena pesada una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 2 ó SEC ID nº 10

, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 3 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 4, y como CDR de región variable de cadena ligera, una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 6, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 7 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 8.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2011/064487.

Solicitante: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG.

Inventor/es: BRANDT, MICHAEL, SEEBER, STEFAN, KALUZA,Klaus, FISCHER,JENS, JENEWEIN,STEFAN, SAMY,EILEEN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/28 (contra receptores, antígenos celulares de superficie o determinantes celulares de superficie)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/395 (Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario)
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Anticuerpos contra la IL-18R1 y usos de los mismos.
Anticuerpos contra la IL-18R1 y usos de los mismos.

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DESCRIPCIÓN

Anticuerpos contra la IL-18R1 y usos de los mismos Campo de la invención La presente invención se refiere a anticuerpos contra la IL-18R1 humana (anticuerpos de IL-18R1 o anticuerpo de IL-18Rα), a anticuerpos que no se unen al factor del complemento C1q, a métodos para su producción, a composiciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos y a usos de los mismos.

Antecedentes de la invención IL-18 es un miembro de la superfamilia de las citoquinas IL-1. Es un regulador importante de la inmunidad innata y adaptativa y presenta efectos sinérgicos con IL-2, induciendo la diferenciación del linaje Th1/Tc1, induce la maduración de las células T y NK, estimula la producción de IFNγ, TNF-α y GM-CSF, regula la acumulación, función y apoptosis celular de macrófagos y neutrófilos, y contribuye a las respuestas de Th2 mediante la estimulación de la producción de IgE y la diferenciación de Th2 en presencia de IL-4 ó IL-2. El receptor de IL-18 (IL-18R1) consiste de subunidades de unión de ligando (IL-18R1) y de transducción de señales (IL-18R1) (revisados en Nakanishi K. et al., Ann. Rev. Immunol. 19:423-474, 2001).

IL-18 aparentemente modula la inflamación en múltiples puntos de control y se considera una diana terapéutica potencial. Algunos estudios anteriores han demostrado que las células T IFNα y CD8 desempeñan una o más funciones importantes en la patogénesis del enfisema pulmonar (Grumelli S. et al., PLoS Medicine 1:75-83, 2004; Ma et al., J. Clin. Invest. 115:3460-3472, 2005; Wang Z. et al., J. Exp. Med. 192:1587-1599, 2000; Sutherland y Cherniack, N. Engl. J. Med. 350:2689-2697, 2004). IL-18 desempeña un papel importante en la diferenciación del linaje Th1/Tc1 y en la producción de citoquinas (Hoshino et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 176:49-62, 2007). En un modelo murino, el humo del tabaco (HT) induce y activa la IL-18 en ratones, IL-18R1α desempeña un papel crucial en la patogénesis e inflamación y destrucción alveolar inducidas por el HT (Kang M.J. et al., J. Immunol. 178:1948, 2007; Kang M.J., J. Clin. Invest. 118:2771, 2008).

La IL-18R1 humana (receptor 1 de la interleuquina 18, IL-18Rα, miembro A de la familia de tipo antígeno CD218, CD218a, UniProtKB/Swiss-Prot Q13478, SEC ID nº 72) es un receptor de la interleuquina 18 (IL-18) y una proteína membranal de tipo I de paso único. La unión a la agonista conduce a la activación de NF-kappa-B. Se expresa IL- 18R1 en pulmón, leucocitos, bazo, hígado, timo, próstata, intestino delgado, colon, placenta y corazón, y se encuentra ausente en cerebro, músculo esquelético, páncreas y riñón. Se observa un nivel alto de expresión en líneas celulares de enfermedad de Hodgkin. Se menciona el IL-18R1 en Parnet P. et al., J. Biol. Chem. 271:3967- 3970, 1996; Torigoe K. et al., J. Biol. Chem. 272:25737-25742, 1997).

Se menciona la IL-18R1 y el anticuerpo contra IL-18R1 en los documentos nº US 7704945, nº US 7615220, nº US 7169581, nº US 7141393, nº US 6600022, nº EP 1047781, nº WO 2010/011697, nº WO 2009/015284, nº WO 2009/015284, nº WO 2009/074634, nº WO 2009/015284, nº WO 2007/117577, nº WO 2008/027236, nº WO 2007/117577, nº WO 2007/096398, nº WO 2005/097998A3, nº WO 2006/009114, nº WO 2005/097998, nº WO 2005/012352, nº WO 2003/080104, nº WO 2003/057821, nº WO 2003/008452A3, nº WO 2003/012061, nº WO 2001/085201, nº WO 2002/008272, nº WO1999/037772 y en Nishida Y. et al., Hybridoma 17(6):577-580, 1998.

El objetivo de la invención es proporcionar anticuerpos contra IL-18R1 que resultan útiles como agente terapéutico para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, tales como enfermedades mediadas por TH1, especialmente EPOC, enfermedades autoinmunológicas, artritis reumatoide, lupus y enfermedades soriáticas.

Descripción resumida de la invención En la presente memoria se da a conocer un anticuerpo aislado ligante de IL-18R1 humano y que se caracteriza porque se une al mismo epítopo de IL-18R1 humano al que se une el anticuerpo monoclonal 1G12, que comprende como secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada, SEC ID nº 1, y como secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera, SEC ID nº 5, en el que dicho anticuerpo se une al IL-18R1 humano con una afinidad de unión de 10-8 M o inferior.

La invención se refiere a un anticuerpo aislado que se une a IL-18R1 humano y que se caracteriza porque comprende como CDR de región variable de cadena pesada una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 2 ó SEC ID nº 10, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 3 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 4, y como CDR de región variable de cadena ligera, una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 6, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 7, y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 8. Por lo tanto, únicamente la región CDRH1 de los anticuerpos 1G12 y 2D11 es diferente y las otras regiones de CDR son idénticas (ver III. Descripción del listado de secuencias).

Una realización de la invención es un anticuerpo aislado ligante de IL-18R1 humano y que se caracteriza porque comprende como CDR de región variable de cadena pesada una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 2 ó SEC ID nº 10, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 3 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 4, y como CDR de región variable de cadena ligera, una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 6, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 7 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 8. En una realización, el anticuerpo según la invención se caracteriza porque el dominio variable de cadena pesada comprende como CDR:a) una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 2, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 3 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 4, o b) una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 10, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 3 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 4 En otra realización, el anticuerpo según la invención se caracteriza porque el dominio variable de cadena ligera comprende como CDR una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 6, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 7 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 8.

En otra realización, el anticuerpo según la invención se caracteriza porque el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera comprenden como CDR: a) una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 2, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 3 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 4, y una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 6, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 7 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 8 ó b) una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 10, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 3 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 4, y una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 6, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 7 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 8.

La invención se refiere a un anticuerpo ligante de IL-18R1 humano y que se caracteriza porque comprende como región variable de cadena pesada, la secuencia SEC ID nº 1, y como región variable de cadena ligera la secuencia SEC ID nº 5 ó porque comprende como región variable de cadena pesada la secuencia SEC ID nº 9 y como región variable de cadena ligera, la secuencia SEC ID nº 11, La invención se refiere además a versiones humanizadas diferentes de los anticuerpos anteriormente indicados según la invención. Por lo tanto, la invención se refiere además a un anticuerpo humanizado caracterizado porque comprende: a) como CDR de región variable de cadena pesada, una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 30, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 31 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 32 y como región variable de cadena ligera una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 34, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 35 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 36 b) como CDR de región variable de cadena pesada, una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 38, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 39 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 40 y como región variable de cadena ligera una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 42, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 43 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 44 c) como CDR de región variable de cadena pesada, una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 46, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 47 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 48 y como región variable de cadena ligera una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 50, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 51 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 52 d) como CDR de región variable de cadena pesada, una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 54, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 55 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 56 y como región variable de cadena ligera una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 58, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 59 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 60, o e) como CDR de región variable de cadena pesada, una región CDRH de secuencia SEC ID nº 62, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 63 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 64 y como región variable de cadena ligera una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 66, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 67 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 68.

En una realización, el anticuerpo humanizado según la invención se caracteriza porque comprende: a) como región variable de cadena pesada, SEC ID nº 29, y como región variable de cadena ligera, SEC ID nº 33, b) como región variable de cadena pesada, SEC ID nº 37, y como región variable de cadena ligera, SEC ID nº 41, c) como región variable de cadena pesada, SEC ID nº 45, y como región variable de cadena ligera, SEC ID nº 49, d) como región variable de cadena pesada, SEC ID nº 53, y como región variable de cadena ligera, SEC ID nº 57, o e) como región variable de cadena pesada, SEC ID nº 61, y como región variable de cadena ligera, SEC ID nº 65.

Una realización de la invención es un anticuerpo anti-IL-18R1 aislado en el que el anticuerpo comprende secuencias de regiones determinantes de complementariedad (CDR) seleccionadas de entre: (a) una secuencia de CDR-L1 que comprende los aminoácidos XASKSVSTSGDSYMH (SEC ID nº 69), en la que X es R o Q, (b) una secuencia de CDR-L2 que comprende los aminoácidos LASNLES (SEC ID nº 7), (c) una secuencia de CDR-L3 que comprende los aminoácidos QQSRELPLS (SEC ID nº 8), (d) una secuencia de CDR-H1 que comprende los aminoácidos XYTFT (SEC ID nº 70), en la que X es D o G, (e) una secuencia de CDR-H2 que comprende los aminoácidos TIDPSDSYTYYX1QKX2X3G (SEC ID nº 71), en la que X1 es N o A, X2 es F o A, y X3 es K o Q, y (f) una secuencia de CDR-H3 que comprende los aminoácidos SGDYDADRYFDV (SEC ID nº 4). Se dan a conocer además en la presente memoria versiones humanizadas de los anticuerpos anteriormente indicados.

Se da a conocer en la presente memoria un anticuerpo ligante de IL-18R1 humano y que se caracteriza porque se une al mismo epítopo de IL-18R1 al que se une el anticuerpo monoclonal 1G12. Por lo tanto, el anticuerpo se une al dominio 2 de IL-18R1. Un anticuerpo ejemplar es el anticuerpo 2D11 según la invención.

El anticuerpo preferentemente es un anticuerpo monoclonal y, además, un anticuerpo quimérico que comprende una cadena constante humana o un anticuerpo humanizado. Resulta especialmente preferente es un anticuerpo humanizado. El anticuerpo según la invención preferentemente comprende una parte Fc de origen humano. Los dominios variables de cadena ligera del anticuerpo según la invención preferentemente son de isotipo lambda humano. Una realización preferente de la invención es una variante quimérica o humanizada del anticuerpo 1G12 o del anticuerpo 2D11. Preferentemente, el anticuerpo según la invención se caracteriza por las secuencias de aminoácidos o fragmentos y propiedades de secuencias de aminoácidos anteriormente indicados.

Preferentemente, el anticuerpo según la invención es de isotipo IgG1 o IgG4 humano. El anticuerpo según la invención preferentemente es de isotipo IgG1 modificado en la región bisagra en aproximadamente las posiciones aminoácidas 216 a 240, preferentemente en aproximadamente las posiciones 220 a 240, entre CH1 y CH2 y/o en la segunda región interdominio en aproximadamente las posiciones aminoácidos 327 a 331 entre CH2 y CH3. Preferentemente, el anticuerpo según la invención se caracteriza porque es del isotipo IgG1 humano, preferentemente comprendiendo la mutación L234A, que es alanina en lugar de leucina en la posición aminoácida 234, y la mutación L235A, que es alanina en lugar de leucina en la posición aminoácida 235. Las posiciones aminoácidas pueden variar para diferentes alotipos en aproximadamente una o dos posiciones, de manera que la leucina en la posición aminoácida 234 podría encontrarse localizada en, por ejemplo, la posición 235 en dicho alotipo. Por lo tanto, la expresión “leucina en la posición aminoácida 234” se refiere a leucina situada en la posición aminoácida 234 ó en una o dos posiciones anteriores o posteriores.

El anticuerpo según la invención preferentemente es del isotipo IgG4 humano con o sin la mutación S228P.

El anticuerpo preferentemente se caracteriza además por una afinidad de 10-8 M (KD) o inferior, preferentemente de entre aproximadamente 10-8 y 10-13 M, preferentemente de entre aproximadamente 10-9 y 10-13 M en la unión al IL- 18R1 humano. Preferentemente, un anticuerpo según la invención se une (reacciona cruzadamente) también a IL- 18R1 de mono Cynomolgus.

La invención proporciona además métodos para la producción recombinante de dichos anticuerpos. La invención comprende además un método para la producción de un anticuerpo recombinante según la invención, caracterizado por la expresión de un ácido nucleico codificante de un anticuerpo ligante de IL-18R1 en una célula huésped CHO y la recuperación de dicho anticuerpo a partir de dichas células. La invención proporciona además un ácido nucleico codificante de un anticuerpo según la invención.

En la presente memoria se da a conocer además la utilización de un anticuerpo según la invención para el tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedades inflamatorias, autoinmunológicas, artritis reumatoide, lupus, soriasis o enfermedades óseas. La invención comprende además la utilización de un anticuerpo según la invención para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades, preferentemente de enfermedades inflamatorias, autoinmunológicas, lupus, soriasis o enfermedades óseas. La invención comprende además un método para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades, pereferentemente de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), enfermedades inflamatorias, autoinmunológicas, artritis reumatoide, lupus, soriasis o enfermedades óseas, caracterizado porque comprende un anticuerpo según la invención. Los anticuerpos según la invención se caracterizan por las propiedades anteriormente indicadas.

Se da a conocer además en la presente memoria métodos para el tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedades inflamatorias, autoinmunológicas, artritis reumatoide, lupus, soriasis o enfermedades óseas, que comprende administrar en un paciente en el que se ha diagnosticado una de dichas enfermedades (y por lo tanto que necesita dicha terapia), un anticuerpo contra IL-18R1 según la invención. El anticuerpo puede administrarse solo, en una composición farmacéutica o alternativamente en combinación con otros medicamentos para el tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva cróncia (COPD), enfermedades inflamatorias, autoinmunológicas, artritis reumatoide, lupus, soriasis o enfermedades óseas. El anticuerpo se administra en una cantidad farmacéuticamente efectiva.

La invención comprende además la utilización de un anticuerpo según la invención para el tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedades inflamatorias, autoinmunológicas, artritis reumatoide, lupus, soriasis o enfermedades óseas y para la preparación de una composición farmacéutica según la invención. Además, la invención comprende un método para la preparación de una composición farmacéutica según la invención.

La invención comprende además un anticuerpo según la invención para el tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedades inflamatorias, autoinmunológicas, artritis reumatoide, lupus, soriasis o enfermedades óseas.

La invención comprende además una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo según la invención, opcionalmente con un tampón y/o un adyuvante útiles para la formulación de anticuerpos con fines farmacéuticos.

La invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos en un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición farmacéutica puede incluirse en un artículo manufacturado o kit. La invención proporciona además la utilización de un anticuerpo según la invención para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de cáncer o de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), enfermedaes inflamatorias, autoinmunológicas, artritis reumatoide, lupus, soriasis o enfermedades óseas. El anticuerpo se utiliza en una cantidad farmacéuticamente efectiva.

La invención comprende además la utilización de un anticuerpo según la invención para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedades inflamatorias, autoinmunológicas, artritis reumatoide, lupus, soriasis o enfermedades óseas. El anticuerpo se utiliza en una cantidad farmacéuticamente efectiva.

Los anticuerpos según la invención presentan propiedades nuevas e inventivas que causan un beneficio para un paciente que sufre una enfermedad asociada a la señalización mediada por el receptor IL-18 y a la activación de la ruta de NFkappaB.

Los anticuerpos según la invención presentan propiedades nuevas e inventivas y se unen a IL-18R1 e inhiben la unión de IL-18 a IL-18R1. En consecuencia, se inhibe la formación del complejo entre IL-18R1 e IL-18RAP y la señalización por el complejo de receptor de IL-18. Lo anterior inhibe la activación de la ruta de NFkappaB.

Breve descripción de las figuras Figura 1: FACS contra células HEK293 transfectadas con IL-18Rα/IL-18Rβ humano. Figura 2: FACS contra células HEK293 transfectadas con IL-18Rα/IL-18Rβ de mono Cynomolgus.

Descripción detallada de realizaciones de la invención I. Definiciones Un “marco humano aceptor” para los fines de la presente memoria es un marco que comprende la secuencia de aminoácidos de un marco de dominio variable de cadena ligera (VL) o un marco de dominio variable de cadena pesada (VH) derivado de un marco de inmunoglobulina humana o un marco de consenso humano, tal como se ha definido anteriormente. Un marco humano aceptor “derivado de” un marco de inmunoglobulina humana o de un marco de consenso humano puede comprender la misma secuencia de aminoácidos del mismo, o puede contener cambios de la secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, el número de cambios de aminoácidos es de 10 ó inferior, de 9 ó inferior, de 8 ó inferior, de 7 ó inferior, de 6 ó inferior, de 5 ó inferior, de 4 ó inferior, de 3 ó inferior o de 2 ó inferior. En algunas realizaciones, el marco humano del aceptor de VL presenta una secuencia idéntica a la secuencia de marco de la VL de inmunoglobulina humana o a la secuencia de marco de consenso humana.

El término “afinidad” se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “afinidad de unión” se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de una pareja de unión (por ejemplo anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X para su pareja Y puede representarse de manera general con la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse mediante métodos comunes conocidos de la técnica, incluyendo los indicados en la presente memoria. A continuación se describen realizaciones ilustrativas y ejemplares específicas para la medición de la afinidad de unión.

Las expresiones “anticuerpo anti-IL-18R1” y “un anticuerpo que se une a IL-18R1” se refieren a un anticuerpo que es capaz de unirse a IL-18R1 humano con suficiente afinidad suficiente para que el anticuerpo resulte útil como agente diagnóstico y/o terapéutico en el reconocimiento de IL-18R1. En una realización, el grado de unión de un anticuerpo anti-IL-18R1 a una proteína no IL-18R1 no relacionada es inferior a aproximadamente 10% de la unión del anticuerpo a IL-18R1 según medición mediante resonancia de plasmón superficial. En determinadas realizaciones, un anticuerpo que se una a IL-18R1 presenta una constante de disociación (Kd) de 10-8 M o inferior, por ejemplo de entre 10-8 M y 10-13 M, por ejemplo de entre 10-9 M y 10-13 M.

El término “anticuerpo” en la presente memoria se utiliza en el sentido más amplio y comprende diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo, aunque sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, con la condición de que muestren la actividad de unión a antígeno deseada.

Un “fragmento de anticuerpo” se refiere a una molécula diferente de un anticuerpo intacto que comprende una parte de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo scFv) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

El término “cáncer” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a enfermedades proliferativas, tales como linfomas, leucemias linfocíticas, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), cáncer pulmonar de células bronquiolo-alveolares, cáncer óseo, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de los tubos de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cérvix, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula adrenal, sarcoma del tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de tiñón o uretra, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasma del sistema nervioso central (SNC), tumores del eje espinal, glioma del tallo cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependinomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma pituitario y sarcoma de Ewings, incluyendo las versiones refractarias de cualquiera de los cánceres anteriormente indicados, o de una combinación de uno o más de los cánceres anteriormente indicados.

El término “quimérico” referido a un anticuerpo se refiere a un anticuerpo en el que una parte de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.

La “clase” de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que presenta su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpo: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y algunas de ellas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan α, δ, ε, γ y μ, respectivamente. El anticuerpo según la invención preferentemente se caracteriza porque es de la subclase IgG1 humana con las mutaciones PVA236 (PVA236 se refiere a que la secuencia de aminoácidos ELLG (proporcionada en el código de aminoácidos de una letra) entre las posiciones aminoácidas 233 a 236 de IgG1 o EFLG de IgG4 es sustituida por PVA), L234A/L235A y/o GLPSS331 (GLPSS331 se refiere a que en la región 331 ALPAP de IgG1 o GLPAP de IgG2 se modifica por GLPSS) o de la subclase IgG4. En una realización preferente adicional de la invención, el anticuerpo se caracteriza por ser de cualquier clase de Ig, siendo preferentemente IgG1 ó IgG4, conteniendo por lo menos una mutación en E233, L234, L235, G236, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 y/o P329 (numeración según el índice EU). Resultan especialmente preferentes las mutaciones de IgG1 PVA236, L234A/L235A y/o GLPSS331, así como la mutación de IgG4 denominada L235E. Resulta adicionalmente preferente que el anticuerpo de la subclase IgG4 contenga la mutación S228P o las mutaciones S228P y L235E (Angal S. et al., Mol. Immunol. 30:105-108, 1993). Por lo tanto, el anticuerpo según la invención preferentemente es un anticuerpo de la subclase IgG1 humana, que contiene una o más mutaciones de PVA236, GLPSS331 y/o L234A/L235A (numeración según el índice EU).

El término "enfermedad" se refiere a una enfermedad mediada por IL18R1. Entre estas enfermedades mediadas por IL18R1 se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis de Lyme, artritis soriática, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad intestinal inflamatoria, diabetes mellitus insulino-dependiente, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, soriasis, dermatitis, escleroderma, enfermedad de injerto contra el huésped, rechazo del trasplante de órgano, enfermedad inmunológica aguda o crónica asociada al trasplante de órgano, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los riñones, hepatitis activa crónica, uveitis, choque séptico, síndrome del choque tóxico, síndrome de la sepsis, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversal aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, ictus, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, neoplasias, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, enfermedad de Addison, deficiencia poliglandular esporádica de tipo I y deficiencia poliglandular de tipo II, síndrome de Schmidt, síndrome del distrés respiratorio adulto, alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía soriática, artropatía colítica ulcerosa, sinovitis enteropática, artropatía asociada a clamidia, Yersinia y Salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa, arterioesclerosis, alergia atópica, enfermedad bullosa autoinmunológica, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, enfermedad de IgA lineal, anemia hemolítica autoinmunológica, anemia hemolítica Coombs-positiva, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/enfermedad del Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de células gigantes, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmunológica criptogénica, síndrome de la inmunodeficiencia humana adquirida, enfermedades relacionadas con la inmunodeficiencia adquirida, hepatitis C, inmunodeficiencia común variable, hipogammaglobulinemia variable común, cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, insuficiencia ovárica, insuficiencia ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad del tejido conectivo asociada a enfermedad pulmonar intersticial, enfermedad mixta del tejido conectivo asociada a enfermedad pulmonar, esclerosis sistémica asociada a enfermedad pulmonar intersticial, artritis reumatoide asociada a enfermedad pulmonar intersticial, lupus eritematoso sistémico asociado a enfermedad pulmonar, enfermedad pulmonar asociada a dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada a enfermedad de Sjögren’s, enfermedad pulmonar asociada a espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada a hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida farmacológicamente, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterante, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar infiltrante linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial post-infecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoimmunológica, hepatitis autoinmunológica de tipo 1, hepatitis autoinmunológica o lupoide clásica, hepatitis autoinmunológica de tipo 2, hepatitis de anticuerpos anti-LKM, hipoglucemia mediada autoinmunológicamente, resistencia a la insulina de tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmunológica aguda asociada al trasplante de órgano, enfermedad inmunológica crónica asociada al trasplante de órgano, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, soriasis de tipo 1, soriasis de tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmunológica, NOS de enfermedad renal, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los riñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad espermática, todos los subtipos de la esclerosis múltiple, oftalmia simpática, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad del tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de la poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, enfermedad/arteritis de Takayasu, trombocitopenia autoimmunológica, trombocitopenia idiopática, enfermedad tiroidea autonmunológica, hypertiroidismo, hipotiroidismo autoinmunológica gotosa o enfermedad de Hashimoto, hipotiroidismo autoinmunológica atrófica, mixoedema primaria, uveitis facogénica, vasculitis primaria, vitíligo, enfermedades hepáticas agudas, enfermedades hepáticas crónicas, alergia y asma, trastornos mentales, depresión, esquizofrenia y enfermedades mediadas por Th2 y mediadas por Th1.

La expresión “funciones efectoras” se refiere a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo que varían con el isotipo del anticuerpo. Entre los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo se incluyen: unión de C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión de receptor de Fc, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis, regulación negativa de los receptores de superficie celular (por ejemplo receptores de células B) y activación de las células B.

Una “cantidad eficaz” de un agente, por ejemplo de una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad que resulta eficaz, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

La expresión “mismo epítopo” se refiere a un anticuerpo según la invención, caracterizado por la inhibición de la unión del anticuerpo 1G12 a IL-18R1. Un anticuerpo resulta inhibido en su unión a IL-18R1 en el caso de que el anticuerpo se una al mismo epítopo de IL-18R1 que el anticuerpo 1G12 o en el caso de que resulte inhibido en su unión a IL-18R debido a impedimentos estéricos de unión por parte de dicho anticuerpo de referencia. La inhibición de la unión entre IL-18R1 y un anticuerpo que debe investigarse puede detectarse mediante ensayo RPS (BIACORE). El anticuerpo anti-IL-18R1 que debe investigarse es capturado por un anticuerpo antiespecie acoplado a la superficie del chip a una concentración de 6 μg/ml (corresponde a 40 nM). A continuación, se inyectan 2,5 μg/ml de proteína IL-18R1 (corresponde a fusión de IL-18R1-Fc 20 nM) a una concentración de 20 nM en la superficie recubierta con anticuerpo. Para el análisis, se añade anticuerpo 1G12 a una concentración de 50 nM sobre dicha superficie durante 2 minutos y se mide la unión. Tras la inyección, cualquier reducción de señal o ningún cambio de la señal indica que el anticuerpo a investigación inhibe la unión de 1G12 a IL-18R1. En el caso de que además se encuentre el mismo resultado para el mismo ensayo, en el que, sin embargo, se haya inmovilizado el anticuerpo 1G12 y se haya añadido el anticuerpo bajo investigación, se dice que el anticuerpo bajo investigación se ha unido al "mismo epítopo". En contraste, un incremento de por lo menos 10% de la señal derivada por la inyección de anticuerpo en por lo menos uno de ambos ensayos, demuestra que el anticuerpo a investigación no inhibe la nión de 1G12 a IL-18R1.

Se ha encontrado además, que un anticuerpo que se une al mismo epítopo al que se une el anticuerpo 1G12, también se une a un IL-18R1 mutado, en el que la mutación consiste de la mutación D1 SRIAL (SEC ID nº 19) a PRVTF (SEC ID nº 20), la mutación D1 de MKNYTQK (SEC ID nº 21) a VGNDRRN (SEC ID nº 22), la mutación D2 QTLVNSTS (SEC ID nº 23) a EELIQDTW (SEC ID nº 24), la mutación D2 NPTIKKN (SEC ID nº 25) a TPRILKD (SEC ID nº 26), o la mutación D2 de HFLHHNGKLF (SEC ID nº 27) a FSVHHNGTRY (SEC ID nº 28). Se ha encontrado además que un anticuerpo que se une al mismo epítopo al que se une el anticuerpo 1G12, no se une a un IL-18R1 mutado, en el que se delecionan los dominios D1 y D2. Según lo mencionado anteriormente, una desviación de la señal para la unión de RPS a un IL-18R1 mutado tal como se ha indicado anteriormente que no excede 20% de la señal derivada mediante la unión de IL-18R1 no mutado demuestra que el anticuerpo que debe investigarse se une también a una variante de IL-1R1 mutada tal como se ha indicado anteriormente.

Una “parte o región Fc de un anticuerpo” es una expresión bien conocida por el experto en la materia y que se define basándose en el corte con papaína de los anticuerpos. La expresión define una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene por lo menos una parte de la región constante. La expresión incluye las regiones de Fc de secuencia nativa y las regiones de Fc variantes. En una realización, una región Fc de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo-terminal de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fc puede encontrarse presente o no. A menos que se indique lo contrario en la presente memoria, la numeración de los residuos aminoácidos en la región Fc o en la región constante se lleva a cabo según el sistema de numeración EU, también denominado índice EU, tal como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Preferentemente, la parte Fc es una parte Fc humana y resulta especialmente preferente de la subclase IgG4 humana, preferentemente mutada en la región bisagra (por ejemplo S228P y/o L235E) o una parte Fc mutada de la subclase IgG1 humana. Resultan más preferentes las partes Fc que comprenden las regiones constantes de cadena pesada seleccionadas de entre las regiones mostradas en SEC ID nº 14, 15, 16, 17 y 18. Las regiones constantes de cadena ligera preferentes se muestran en las secuencias SEC ID nº 12 y 13.

El término “marco” o "FR” se refiere a residuos de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable (RHV). La FR de un dominio variable generalmente consiste de cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. De acuerdo con lo anterior, las secuencias de CDR y de FR generalmente aparecen en la secuencia siguiente en VH (o en VL): FR1-CDR1(L1)-FR2-CDR2(L2)-FR3-CDR3(L3)-FR4.

Las expresiones “anticuerpo de longitud completa”, “anticuerpo intacto” y “anticuerpo completo” se utilizan intercambiablemente en la presente memoria para referirse a un anticuerpo que presenta una estructura sustancialmente similar a la estructura nativa de un anticuerpo o que presenta cadenas pesadas que contienen una región Fc tal como se ha definido en la presente memoria.

Las expresiones “célula huésped”, “línea celular huésped” y “cultivo de células huésped” se utilizan intercambiablemente y se refieren a células en las que se han introducido ácidos nucleicos exógenos, incluyendo la progenie de dichas células. Entre las células huésped se incluyen “transformantes” y “células transformadas”, que incluyen la célula transformada primaria y la progenie derivada de la misma con independencia del número de pases. La progenie puede no ser completamente idéntica en su contenido de ácidos nucleicos a una célula parental, pero puede contener mutaciones. La progenie mutante que presenta la misma función o actividad biológica según el cribado o selección de entre las células originalmente transformadas se encuentra incluida en la presente memoria.

Un “marco de consenso humano” es un marco que representa los residuos aminoácidos más comunes en una selección de secuencias de marco de VL o VH de inmunoglobulina humana. Generalmente, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana procede de un subgrupo de secuencias de dominio variable. Generalmente, el subgrupo de secuencias es un subgrupo tal como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD, 1991, vols. 1 a 3. En una realización, para la VL, el subgrupo es el subgrupo kappa 1 tal como en Kabat et al., supra. En una realización, para la VH, el subgrupo es el subgrupo III tal como en Kabat et al., supra.

Un anticuerpo “humanizado” se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende los residuos aminoácidos de CDR no humanas y los residuos aminoácidos de FR humanas. En determinadas realizaciones, un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables en los que la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de las CDR corresponden a las de un anticuerpo no humano, y la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender por lo menos una parte de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una “forma humanizada” o “versión humanizada” o “anticuerpo humanizado” de un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha sido sometido a humanización. En una realización, entre una y la totalidad de las seis CDR de un anticuerpo derivado de una especie no humana (por ejemplo el hámster) se injertan en la región marco de un anticuerpo humano para preparar el “anticuerpo humanizado”. Ver, por ejemplo, Riechmann L. et al., Nature 332:323-327, 1988, y Neuberger M.S. et al., Nature 314:268-270, 1985. En una realización, una “versión humanizada de un anticuerpo” según la invención (que es de origen no humano) se refiere a un anticuerpo, que se basa en las secuencias de anticuerpo no humanas en las que VH y VL se humanizan mediante técnicas estándares (incluyendo la injertación de CDR) y opcionalmente la mutagénesis posterior de determinados aminoácidos en la región marco y la CDR. En una realización, pueden modificarse uno a cinco aminoácidos (por ejemplo hasta tres) en la región marco y/o uno a tres aminoácidos (por ejemplo hasta dos) en las CDR pueden modificarse con mutaciones adicionales. Por ejemplo, la mutagénesis puede basarse en el modelado molecular, tal como describen Riechmann L. et al., Nature 332:323-327, 1988, y Queen C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989, u otros. Las posiciones adecuadas para dichas mutaciones pueden identificarse, por ejemplo, mediante análisis de secuenciación o de homologías, mediante la selección del marco humano (enfoque de marcos fijos, identificación de homologías o de ajuste óptimo) mediante la utilización de secuencias de consenso, mediante la selección de FR de varias líneas germinales diferentes o mediante la sustitución de residuos no humanos en la superficie tridimensional por los residuos más comunes de los anticuerpos humanos o basándose en interacciones estéricas optimizadas . En una realización, dicha versión humanizada se quimeriza con una región constante humana.

La expresión “regiones determinantes de complementariedad” o “CDR”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que presentan una secuencia hipervariable y/o que forman bucles estructuralmente definidos (“bucles hipervariables”) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991; Chothia C. y Lesk A.M., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987). Con la excepción de la CDR1 en VH, las CDR generalmente comprenden los residuos aminoácidos que forman los bucles hipervariables. Generalmente, los anticuerpos de cuatro cadenas nativos comprenden seis CDR, tres en la VH (H1, H2 y H3) y tres en la VL (L1, L2 y L3). Las RHV generalmente comprenden residuos aminoácidos de los bucles hipervariables y/o de las “regiones determinantes de complementariedad” (CDR), presentando éstas últimas una variabilidad de secuencia más alta y/o participando en el reconocimiento de antígeno. Las CDR ejemplares se encuentran en los residuos aminoácidos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2), 91 a 96 (L3), 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) y 96 a 102 (H3) (Chothia C. y Lesk A.M., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987) o en los residuos aminoácidos 24 a 34 de L1, 50 a 56 de L2, 89 a 97 de L3, 31 a 35B e H1, 50 a 65 de H2 y 95 a 102 de H3 (Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, publicación del NIH nº 91-3242). Con la excepción de la RDC1 en VH, las RDC generalmente comprenden los residuos aminoácidos que forman los bucles hipervariables. Las SDR se encuentran contenidas dentro de las regiones de las CDR denominadas CDR abreviadas, o CDR-a. Las CDR-a ejemplares (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 y a-CDR-H3) se encuentran en los residuos aminoácidos 31 a 34 de L1, 50 a 55 de L2, 89 a 96 de L3, 31 a 35B de H1, 50 a 58 de H2 y 95 a 102 de H3 (ver Almagro J.C. y Fransson J., Front Biosci. 13:1619-1633, 2008). A menos que se indique lo contrario, los residuos de CDR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo los residuos de FR) se numeran en la presente memoria según Kabat et al., supra.

Un “inmunoconjugado” es un anticuerpo conjugado con una o más moléculas heterólogas.

Un “individuo” o “sujeto” es un mamífero. Entre los mamíferos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, animales domesticados (por ejemplo vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo seres humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo ratones y ratas). En determinadas realizaciones, el individuo o sujeto es un ser humano.

Un anticuerpo “aislado” es un anticuerpo que ha sido separado de un componente de su medio natural. En algunas realizaciones, un anticuerpo se purifica hasta una pureza superior a 95% ó 99% según se determina mediante, por ejemplo, métodos cromatográficos (por ejemplo HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los métodos de evaluación de la pureza de los anticuerpos ver, por ejemplo, Flatman S. et al., J. Chromatogr. B 848:79-87, 2007.

Un ácido nucleico “aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que ha sido separada de un componente de su medio natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenido en células que habitualmente contienen la molécula de ácido nucleico, aunque la molécula de ácido nucleico se encuentra presente extracromosómicamente o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.

La expresión “ácido nucleico aislado codificante de un anticuerpo anti-IL-18R1” se refiere a una o más moléculas de ácidos nucleicos codificantes de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo (o fragmentos de los mismos), incluyendo una o más de dichas moléculas de ácidos nucleicos en un único vector o en vectores separados, y una o más de dichas moléculas de ácidos nucleicos presentes en una o más localizaciones en una célula huésped.

La expresión “anticuerpo monoclonal” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo que contienen mutaciones naturales o que aparecen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, encontrándose presentes generalmente dichas variantes en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), estando dirigido cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales contra un único determinante de un antígeno. De esta manera, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que deben utilizarse según la presente invención pueden prepararse mediante una diversidad de técnicas, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, el método del hibridoma, los métodos de ADN recombinante, los métodos de expresión fágica y los métodos que utilizan animales transgénicos que contienen la totalidad o parte de los loci de inmunoglobulina humana, estando descritos en la presente memoria dichos métodos y otros métodos ejemplares para la preparación de anticuerpos monoclonales.

Un “anticuerpo desnudo” se refiere a un anticuerpo que no se encuentra conjugado con una fracción heteróloga. El anticuerpo desnudo puede encontrarse presente en una formulación farmacéutica.

Los “anticuerpos nativos” se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG nativos son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se encuentran unidas mediante enlaces disulfuro. De extremo N-terminal a extremo C-terminal, cada cadena pesada presenta una región variable (VH), también denominada dominio pesado variable o un dominio variable de cadena pesada, seguido de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De manera similar, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, cada cadena ligera presenta una región variable (VL), también denominada dominio ligero variable o dominio variable de cadena ligera, seguido de un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo puede ser de dos tipos, denominados kappa (κ) y lambda (λ), según la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

La expresión “impresos dentro del paquete” se utiliza para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en los paquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosis, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias referentes a la utilización de dichos productos terapéuticos.

La expresión “porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoácidos en la secuencia polipeptídica de referencia, tras alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencias, y no considerando ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencias. La alineación con fines de determinación del porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos puede realizarse de diversas maneras que se encuentran comprendidas dentro de los conocimientos del experto en la materia, por ejemplo utilizando software informático disponible públicamente, tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). El experto en la materia podrá determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los fines de la presente memoria, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos generados utilizando el programa informático de comparación de secuencias llamado ALIGN-2. El autor del programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 es Genentech, Inc., y el código fuente ha sido presentado con la documentación para usuario en el U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, en donde se encuentra registrado con el nº TXU510087 del U.S. Copyright Office. El programa ALIGN-2 se encuentra disponible públicamente de Genentech Inc., South San Francisco, California, o puede compilarse a partir del código fuente. El programa ALIGN- 2 debería compilarse para la utilización en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no varían.

En la situaciones en las que se utiliza ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencias de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que alternativamente puede expresarse como una secuencia de aminoácidos dada A que presenta o que comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula del modo siguiente: en la que X es el número de residuos aminoácidos puntuados como correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación de este programa de A y B, y en la que Y es el número total de residuos aminoácidos en B. Se aprecia que, en el caso de que la longitud de la secuencia de aminoácidos A no sea igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A frente a B no es igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B frente a A. A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos utilizados en la presente memoria se obtienen tal como se describe en el párrafo inmediatamente anterior utilizando el programa informático ALIGN-2.

La expresión “formulación farmacéutica” se refiere a una preparación que se encuentra en una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma resulte efectiva, y que no contiene componentes adicionales que resulten inaceptablemente tóxicos para un sujeto en el que se administre la formulación.

Un “portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, diferente de un ingrediente activo, que no resulta tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, aunque sin limitación, un tampón, un excipiente, un estabilizador o un conservante.

El término “IL-18R1”, tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la IL-18R1 humana (receptor 1 de la interleuquina-18, IL-18Rα, miembro A de la familia similar al antígeno CD218, CD218a, Q13478 de UniProtKB/Swiss-Prot).

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “tratamiento” (y las variaciones gramaticales del mismo tales como “tratar” o “tratando”) se refieren a la intervención clínica en un intento para alterar el curso natural del individuo bajo tratamiento, y puede llevarse a cabo para la profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Entre los efectos deseables del tratamiento se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la reducción de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la reducción de la velocidad de avance de la enfermedad y la mejora o el alivio del estado de la enfermedad. En algunas realizaciones, se utilizan anticuerpos de la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para enlentecer el avance de la misma.

La expresión “región variable” o “dominio variable” se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que participa en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente presentan estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones marco (FR) y tres regiones hipervariables (RHV) (ver, por ejemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, sexta ed., W.H. Freeman and Co., página 91, 2007). Puede resultar suficiente un único dominio VH o VL para proporcionar especificidad de unión de antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular pueden aislarse utilizando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno con el fin de cribar una biblioteca para dominios VL o VH complementarios, respectivamente (ver, por ejemplo, Portolano S. et al., J. Immunol. 150:880-887, 1993; Clarkson T. et al., Nature 352:624-628, 1991).

El término “vector”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula de ácidos nucleicos capaz de propagar otro ácido nucleico al que se encuentra unido. El término incluye el vector en forma de estructura de ácidos nucleicos autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que ha sido introducido. Determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se encuentran ligados operablemente. Dichos vectores se denominan en la presente memoria “vectores de expresión”.

II. Composiciones y métodos En un aspecto, la invención se basa en anticuerpos que se unen a IL-18R1. Los anticuerpos de la invención resultan útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), las enfermedades inflamatorias, autoinmunológicas, la artritis reumatoide, el lupus, la soriasis o las enfermedades óseas, u otras enfermedades mediadas por IL18R1.

A. Anticuerpos anti-IL-18R1 ejemplares En un aspecto adicional de la invención, un anticuerpo anti-IL-18R1 según cualquiera de las realizaciones anteriores es un anticuerpo monoclonal, que incluye un anticuerpo quimérico o humanizado. En una realización, un anticuerpo anti-IL-18R1 humano es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo un fragmento Fv, Fab, Fab’, scFv, diacuerpo o F(ab’)2. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo un anticuerpo IgG1 intacto u otra clase o isotipo de anticuerpo tal como se define en la presente memoria.

En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-IL-18R1 según cualquiera de las realizaciones anteriores puede incorporar cualquiera de las características, individualmente o en combinación, tal como se describe en las secciones posteriores: En una realización, el anticuerpo humanizado según la invención se caracteriza porque comprende como CDR de región variable de cadena pesada una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 2 ó a la secuencia SEC ID nº 10, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 3 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 4 y como región variable de cadena ligera una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 6, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 7 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 8.

En una realización, el anticuerpo humanizado según la invención se caracteriza porque comprende como región variable de cadena pesada, la secuencia SEC ID nº 1, y como región variable de cadena ligera, la secuencia SEC ID nº 5, o como región variable de cadena pesada, la secuencia SEC ID nº 9, y como región variable de cadena ligera, la secuencia SEC ID nº 11.

En una realización, el anticuerpo según la invención se caracteriza porque comprende: a) como CDR de región variable de cadena pesada, una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 30, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 31 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 32 y como región variable de cadena ligera una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 34, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 35 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 36 b) como CDR de región variable de cadena pesada, una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 38, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 39 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 40 y como región variable de cadena ligera una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 42, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 43 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 44 c) como CDR de región variable de cadena pesada, una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 46, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 47 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 48 y como región variable de cadena ligera una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 50, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 51 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 52 d) como CDR de región variable de cadena pesada, una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 54, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 55 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 56 y como región variable de cadena ligera una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 58, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 59 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 60, o e) como CDR de región variable de cadena pesada, una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 62, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 63 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 64 y como región variable de cadena ligera una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 66, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 67 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 68.

En una realización, el anticuerpo según la invención se caracteriza porque comprende: a) como región variable de cadena pesada, SEC ID nº 29, y como región variable de cadena ligera, SEC ID nº 33, b) como región variable de cadena pesada, SEC ID nº 37, y como región variable de cadena ligera, SEC ID nº 41, c) como región variable de cadena pesada, SEC ID nº 45, y como región variable de cadena ligera, SEC ID nº 49, d) como región variable de cadena pesada, SEC ID nº 53, y como región variable de cadena ligera, SEC ID nº 57, o e) como región variable de cadena pesada, SEC ID nº 61, y como región variable de cadena ligera, SEC ID nº 65.

1. Afinidad de anticuerpos En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente memoria presenta una constante de disociación (KD) de 10-8 M o inferior, por ejemplo de entre 10-8 M y 10-13 M, por ejemplo de entre 10-9 M y 10-13 M.

Se midió KD utilizando ensayos de resonancia de plasmón superficial utilizando un BIACORE®-T100 o un BIACORE®-A100 (GE Healthcare, Freiburg, Alemania) a 25°C con chips CM5 con antígeno inmovilizado al nivel de 10 unidades de respuesta (UR). Brevemente, se activaron chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, GE Healthcare) con hidrocloruro de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) siguiendo las instrucciones del proveedor. Se diluyó el antígeno o un anticuerpo de captura adecuado con acetato sódico 10 mM, pH 4,8, a 5 μg/ml (~0,2 µM) antes de la inyección a un caudal de 5 µl/minuto, alcanzando aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Tras la inyección del proteína, se inyectó etanolamina 1 M para bloquear los grupos no reaccionados. Antes del suceso de unión que debe medirse, una pareja de unión ya se encuentra inmovilizada en la superficie o ha sido captura con un sistema de captura adecuado (por ejemplo anticuerpos específicos de IgG humana para capturas las IgGs humanas). Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie de dos veces de Fab/anticuerpo/antígeno (0,78 nM a 500 nM) en surfactante de PBS con polisorbato 20 al 0,05% (TWEEN-20TM) (PBST) a 25ºC a un caudal de aproximadamente 30 μl/minuto. Tras el suceso de unión, se regenera la superficie para el ciclo siguiente. Las tasas de asociación (ka) y de disociación (kd) se calcularon utilizando un modelo simple de unión uno a uno de Langmuir (software de evaluación BIACORE® T100, versión 4.1) mediante ajuste simultáneo de las curvas de asociación y de disociación. La constante de equilibrio de disociación (KD) se calculó como la proporción kd/ka. Ver, por ejemplo, Chen Y. et al., J.

Mol. Biol. 293:865-881, 1999. En el caso de ka exceda 106 M-1s-1 según el ensayo de resonancia de plasmón superficial indicado anteriormente, la tasa on puede determinarse mediante la utilización de una técnica de inhibición de fluorescencia que mida el incremento o reducción de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación a 295 nm, emisión a 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25ºC de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medidas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro dotado de un sistema de interrupción de flujo.

2. Fragmentos de anticuerpo En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente memoria es un fragmento de anticuerpo.

Entre los fragmentos de anticuerpo se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los fragmentos Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv y scFv, y otros fragmentos indicados posteriormente. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, ver Hudson P.J. et al., Nat. Med. 9:129-134, 2003. Para una revisión de los fragmentos scFv, ver, por ejemplo, Plueckthun, en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore (editores), RPSinger-Verlag, New York (1994), páginas 269 a 315; ver también la patente WO nº 93/16185, y las patentes US nº 5.571.894 y nº 5.587.458. Para un comentario de los fragmentos Fab y F(ab’)2 que comprenden residuos de epítopo ligante de receptor de reciclaje y que presenta una vida media incrementada, ver la patente US nº 5.869.046.

Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Ver, por ejemplo, las patentes EP nº 404.097 y WO nº 1993/01161; Hudson P.J. et al., Nat. Med. 9:129-134, 2003, y Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993. Los triacuerpos y tetracuerpos también se encuentran descritos en Hudson P.J. et al., Nat. Med. 9:129-134, 2003.

Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden la totalidad o una parte del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una parte del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de único dominio es un anticuerpo de único dominio humano (Domantis Inc., Waltham M.A.; ver, por ejemplo, la patente US nº 6.248.516 B1).

Los fragmentos de anticuerpo pueden prepararse mediante diversas técnicas, incluyendo, aunque sin limitación, la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por parte de células huésped recombinantes (por ejemplo E. coli o fagos), tal como se describe en la presente memoria.

3. Anticuerpos multiespecíficos En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente memoria es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que presentan especificidades de unión para por lo menos dos sitios diferentes. En determinadas realizaciones, una de las especificidades de unión es para IL-18R1 y la otra es para cualquier otro antígeno. En determinadas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos diferentes de IL-18R1. Pueden prepararse anticuerpos biespecíficos en forma de anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.

Entre las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos se incluyen, aunque sin limitación, la coexpresión recombinante de dos parejas de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que presentan especificidades diferentes (ver Milstein C. y Cuello A.C., Nature 305:537-540, 1983, el documento nº WO 93/08829, y Traunecker A. et al., EMBO J. 10:3655-3659, 1991) y las construcciones de “botón-en-ojal” (ver, por ejemplo, la patente US nº 5.731.168). También pueden prepararse anticuerpos multiespecíficos mediante la manipulación de efectos de orientación electrostática para la preparación de moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpo (documento nº WO 2009/089004), el entrecruzamiento de dos o más anticuerpos o fragmentos (ver, por ejemplo, la patente US nº 4.676.980, y Brennan M. et al., Science 229:81-83, 1985), la utilización de cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (ver, por ejemplo, Kostelny S.A. et al., J. Immunol. 148:1547-1553, 1992), la utilización de la tecnología de “diacuerpos” para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos (ver, por ejemplo, Holliger P. et

al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993) y la utilización de dímeros de Fv de cadena sencilla (sFv) (ver, por ejemplo, Gruber M. et al., J. Immunol. 152:5368-5374, 1994) y la preparación de anticuerpos triespecíficos tal como se describe en, por ejemplo, Tutt A. et al., J. Immunol. 147:60-69, 1991.

Los anticuerpos manipulados con tres o más sitios de unión de antígeno funcionales, incluyendo los “anticuerpos Octopus” también se encuentran incluidos en la presente memoria (ver, por ejemplo, el documento nº US 2006/0025576A1).

El anticuerpo o fragmento en la presente memoria también incluye un “Fab de doble acción” o “DAF”, que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a IL-18R1, así como a otro antígeno diferente (ver el documento nº US 2008/0069820, por ejemplo).

4. Variantes de anticuerpo a) Variantes de glucosilación En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente memoria se altera para incrementar o reducir el grado con el que se glucosila el anticuerpo. La adición o deleción de sitios de glucosilación a un anticuerpo puede llevarse a cabo convenientemente mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos de manera que se genere o se elimine uno o más sitios de glucosilación.

En el caso de que el anticuerpo comprenda una región Fc, el carbohidrato unido al mismo puede alterarse. Los anticuerpos nativos producidos por las células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que generalmente se une mediante un enlace de nitrógeno a Asn297 del dominio CH2 de la región de Fc (ver, por ejemplo, Wright A. et al., TIBTECH 15:26-32, 1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetil-glucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a una GlcNAc en el “tallo” de la estructura oligosacárida biantenaria. En algunas realizaciones, pueden realizarse modificaciones del oligosacárido en el anticuerpo de la invención con el fin de crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.

La cantidad de fucosa se determina mediante el cálculo de la cantidad media de fucosa dentro de la cadena sacárida en Asn297, respecto a la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn 297 (por ejemplo estructuras complejas, híbridas y ricas en manosa), según medición realizada mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, tal como se describe en el documento nº WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina situado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración EU de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también puede localizarse aproximadamente ± 3 aminoácidos cadena arriba o abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia menores en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden presentar una función ADCC mejorada. Ver, por ejemplo, las publicaciones de patente US nº 2003/0157108 (Presta L.), nº 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Entre los ejemplos de publicaciones relacionadas con las variantes de anticuerpo “desfucosiladas” o “deficientes en fucosa” se incluyen: las patentes US nº 2003/0157108, WO nº 2000/61739, WO nº 2001/29246, US nº 2003/0115614, US nº 2002/0164328, US nº 2004/0093621, US nº 2004/0132140, US nº 2004/0110704, US nº 2004/0110282, US nº 2004/0109865, WO nº 2003/085119, WO nº 2003/084570, WO nº 2005/035586, WO nº 2005/035778, WO nº 2005/053742, WO nº 2002/031140; Okazaki A. et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249, 2004; Yamane-Ohnuki N. et al., Biotech. Bioeng. 87:614-622, 2004. Entre los ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados se incluyen las células CHO Lec13 deficientes en fucosilación de las proteínas (Ripka J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 24:533-545, 1986; la solicitud de patente US nº 2003/0157108 A1, Presta L. y la patente WO nº 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente en el Ejemplo 11) y las líneas celulares con inactivación génica tales como el gen de la alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, las células CHO con inactivación génica (ver, por ejemplo, Yamane-Ohnuki N. et al., Biotech. Bioeng. 87:614-622, 2004; Kanda Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94:680-688, 2006, y la patente WO nº 2003/085107).

Las variantes de anticuerpo se proporcionan además con oligosacáridos bisectados, por ejemplo en los que un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo se encuentra bisectado por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden presentar un nivel reducido de fucosilación y/o una función ADCC mejorada. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpo en, por ejemplo, el documento nº WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.), la patente US nº 6.602.684 (Umana et al.) y el documento nº US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan variantes de anticuerpo con por lo menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden presentar una función CDC mejorada. Se describen dichas variantes de anticuerpo en, por ejemplo, los documentos nº WO 1997/30087 (Patel et al.), nº WO 1998/58964 (Raju S.) y nº WO 1999/22764 (Raju S.).

b) Variantes de región Fc En determinadas realizaciones, pueden introducirse una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en la presente memoria, generando de esta manera una variante de región Fc. La variante de región Fc puede comprender una secuencia de región Fc humana (por ejemplo una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ó IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácido (por ejemplo una sustitución) en una o más posiciones aminoácidas.

En determinadas realizaciones, la invención contempla una variante de anticuerpo que presenta algunas, aunque no todas, las funciones efectoras, lo que la convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la vida media del anticuerpo in vivo resulta importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como el complemento y la ADCC) resultan innecesarias o perjudiciales. Pueden llevarse a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/eliminación de las actividades de CDC y/o de ADCC. Por ejemplo, pueden llevarse a cabo ensayos de unión de receptor de Fc (FcR) que garanticen que el complejo no presenta unión a FcγR (por lo tanto que probablemente no presenta actividad de ADCC), aunque conserva la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en la ADCC, las células NK, únicamente expresan FcγRIII, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcγRII y FcγRIII. La expresión de FcR sobre las células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3, en la página 464 de Ravetch J.V. y Kinet J.P., Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, 1991. Se describen ejemplos no limitativos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés en la patente US nº 5.500.362 (ver, por ejemplo, Hellstrom I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063, 1986) y Hellstrom I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1499-1502, 1985; patente US nº 5.821.337 (ver Brueggemann M. et

al., J. Exp. Med. 166:1351-1361, 1987). Alternativamente, pueden utilizarse métodos de ensayo no radioactivos (ver, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTITM para citometría de flujo (CellTechnology, Inc., Mountain View, CA, y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96®, Promega, Madison, WI). Entre las células efectoras útiles para dichos ensayos se incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo en un modelo animal tal como el dado a conocer en Clynes R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656, 1998. También pueden llevarse a cabo ensayos de unión de C1q para confirmar que el anticuerpo no puede unirse a C1q y que por lo tanto no presenta actividad de CDC. Ver, por ejemplo, la ELISA de la unión de C1q y de C3c en las patentes WO nº 2006/029879 y nº 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, puede llevarse a cabo un ensayo de CDC (ver, por ejemplo, Gazzano-Santoro H. et al., J. Immunol.

Methods 202:163-171, 1996; Cragg M.S. et al., Blood 101:1045-1052, 2003; y Cragg M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743, 2004). Las determinaciones de unión y eliminación/vida media in vivo también pueden llevarse a cabo utilizando métodos conocidos de la técnica (ver, por ejemplo, Petkova S.B. et al., Intl. Immunol. 18:1759-1769, 2006).

Entre los anticuerpos con una función efectora reducida se incluyen aquellos con una sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc nº 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente US nº 6.737.056). Entre dichos Fc mutantes se incluyen los Fc mutantes con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoácidas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo la Fc mutante denominada “DANA”, con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (patente US nº 7.332.581).

Se describen determinadas variantes de anticuerpo con unión mejorada o reducida a FcR (ver, por ejemplo, los documentos nº US 6.737.056 y nº WO 2004/056312, y Shields R.L. et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001).

En determinadas realizaciones, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la ADCC, por ejemplo sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de los residuos).

En algunas realizaciones, pueden realizarse alteraciones en la región Fc que resultan en una unión de C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alterada (es decir, mejorada o reducida), por ejemplo tal como se describe en los documentos nº US 6.194.551, nº WO 99/51642, e Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184, 2000.

Los anticuerpos con vidas medias incrementadas y unión mejorada al receptor de Fc neonatal (FcRn), los cuales son responsable de la transferencia de las IgG maternas hasta el feto (Guyer R.L. et al., J. Immunol. 117:587-593, 1976, y Kim J.K. et al., J. Immunol. 24:2429-2434, 1994), se describen en el documento nº US 2005/0014934A1 (Hinton et al.). Dichos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Entre dichas Fc variantes se incluyen aquéllas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ó 434, por ejemplo la sustitución del residuo 434 de la región Fc (patente US nº 7.371.826).

Ver también Duncan A.R. y Winter G., Nature 332:738-740, 1988, y la patente US nº 5.648.260, la patente US nº 5.624.821 y el documento nº WO 94/29351 referentes a otros ejemplos de variantes de la región Fc.

c) Variantes de anticuerpo con manipulación de las cisteínas En determinadas realizaciones puede resultar deseable crear anticuerpos con manipulación de las cisteínas, por ejemplo los “tioMAb”, en los que se sustituyen uno o más residuos de un anticuerpo por residuos de cisteína. En realizaciones particulares, los residuos sustituidos se encuentran en sitios accesibles del anticuerpo. Mediante la sustitución de aquellos residuos con cisteína, se sitúan los grupos tiol reactivos en sitios accesibles del anticuerpo y pueden utilizarse para conjugar el anticuerpo con otros grupos, tales como grupos farmacológicos o grupos de molécula conectora-fármaco, con el fin de crear un inmunoconjugado, tal como se describe adicionalmente en la presente memoria. En determinadas realizaciones, puede sustituirse por cisteína uno o más cualesquiera de los residuos siguientes: V205 (numeración Kabat) de la cadena ligera, A118 (numeración EU) de la cadena pesada y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Pueden generarse anticuerpos con manipulación de cisteínas tal como se describe en, por ejemplo, la patente US nº 7.521.541.

d) Derivados de anticuerpo En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente memoria puede modificarse adicionalmente para que contenga grupos no proteicos adicionales que son conocidos de la técnica y se encuentran fácilmente disponibles. Entre los grupos adecuados para la derivatización del anticuerpo se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, polímeros solubles en agua. Entre los ejemplos no limitativos de polímeros solubles en agua se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo glicerol), alcohol polivinílico y mezclas de los mismos. El propionaldehído de polietilenglicol puede presentar ventajas de preparación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unido al anticuerpo puede variar, y en el caso de que se una más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros utilizados para la derivatización puede determinarse basándose en consideraciones entre las que se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que debe mejorarse, la opción de que el derivado de anticuerpo se utilice en una terapia bajo condiciones definidas, etc.

En otra realización, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un grupo no proteico que puede calentarse selectivamente mediante exposición a radiación. En una realización, el grupo no proteico es un nanotubo de carbono (Kam N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:11600-11605, 2005). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, aunque sin limitación, longitudes de onda que no dañan las células ordinarias, pero que calientan el grupo no proteico hasta una temperatura a las que las células próximas al anticuerpo-grupo no proteico resultan eliminadas.

B. Métodos y composiciones recombinantes Pueden producirse anticuerpos utilizando métodos y composiciones recombinantes, por ejemplo tal como se describe en la patente US nº 4.816.567. En una realización, se proporciona un ácido nucleico aislado codificante de un anticuerpo anti-IL-18R1 descrito en la presente memoria. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende la VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (por ejemplo las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo). En una realización adicional, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En una realización adicional, se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. En una de dichas realizaciones, una célula huésped comprende (por ejemplo ha sido transformada con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. En una realización, la célula huésped es eucariótica, por ejemplo una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfoide (por ejemplo una célula Y0, NS0 ó Sp20). En una realización, se proporciona un método de preparación de un anticuerpo anti-IL-18R1, en el que el método comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico codificante del anticuerpo, tal como se ha proporcionado anteriormente, bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y opcionalmente recuperar el anticuerpo a partir de las células huésped (o medio de cultivo de las células huésped).

Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-IL-18R1, se aísla un ácido nucleico codificante de un anticuerpo, por ejemplo tal como se ha indicado anteriormente, y se inserta en uno o más vectores para la clonación adicional y/o expresión en una célula huésped. Dicho ácido nucleico puede aislarse fácilmente y secuenciarse utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo mediante la utilización de sondas oligonucleótidas que son capaces de unirse específicamente a genes codificantes de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo).

Entre las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores codificantes de anticuerpos se incluyen las células procarióticas o eucarióticas indicadas en la presente memoria. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos en bacterias, en particular en el caso de que la glucosilación y la función efectora de Fc no resulten necesarias. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, ver, por ejemplo, las patentes US nº 5.648.237, nº 5.789.199 y nº 5.840.523 (ver también Charlton K.A., en: Methods in Molecular Biology, vol. 248, Lo, B.K.C. (editor), Humana Press, Totowa, NJ, 2003, páginas 245 a 254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli). Tras la expresión, el anticuerpo puede aislarse a partir de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y puede purificarse adicionalmente.

Además de procariotas, los microbios eucarióticos tales como los hongos filamentosos o las levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores codificantes de anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levaduras cuyas rutas de glucosilación han sido “humanizadas”, resultando en la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o totalmente humano. Ver Gerngross T.U., Nat. Biotech. 22:1409- 1414, 2004, y Li H. et al., Nat. Biotech. 24:210-215, 2006.

También se derivan células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpos glucosilados a partir de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Entre los ejemplos de células de invertebrado se incluyen las células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas baculovíricas que pueden utilizarse conjuntamente con células de insecto, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También pueden utilizarse cultivos de células vegetales como huéspedes. Ver, por ejemplo, las patentes US nº 5.959.177, nº 6.040.498, nº 6.420.548, nº 7.125.978 y nº 6.417.429 (que describe la tecnología PLANTIBODIESTM para producir anticuerpos en plantas transgénicas). También pueden utilizarse células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden resultar útiles líneas celulares de mamífero adaptadas para el crecimiento en suspensión. Otros ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7), la línea renal embrionaria humana (293 ó células 293 tal como se describe en, por ejemplo, Graham F.L. et al., J. Gen. Virol. 36:59-74, 1977), células renales de hámster neonato (BHK), células de sertoli de ratón (células TM4 tal como se describe en, por ejemplo, Mather J.P., Biol. Reprod. 23:243-252, 1980), las células renales de mono (CV1), las célula renales de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma cervical humano (HELA), células renales caninas (MDCK), células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A), células pulmonares humanas (W138), células hepáticas humanas (Hep G2), tumor mamario de ratón (MMT 060562), células TRI, tal como se describe en, por ejemplo, Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68, 1982; células MRC 5 y células FS4. Entre otras líneas celulares huésped de mamífero útiles se incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo las células CHO DHFR- (Urlaub G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980) y las líneas celulares de mieloma tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas celulares huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, ver, por ejemplo, Yazaki P.J. et al., Methods in Molecular Biology 248:255-268, 2003.

C. Métodos y composiciones para el diagnóstico y detección En determinadas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-IL-18R1 proporcionados en la presente memoria resulta útil para la detección de la presencia de IL-18R1 en una muestra biológica. El término “detección” tal como se utiliza en la presente memoria comprende la detección cuantitativa o cualitativa. En determinadas realizaciones, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como tejido tumoral.

En una realización, se proporciona un anticuerpo anti-IL-18R1 para la utilización en un método de diagnóstico o detección. En un aspecto adicional, se proporciona un método para detectar la presencia de IL-18R1 en una muestra biológica. En determinadas realizaciones, el método comprender poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-IL-18R1 tal como se describe en la presente memoria, bajo condiciones permisivas de la unión del anticuerpo anti-IL-18R1 a IL-18R1, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-IL-18R1 e IL-18R1. Dicho método puede ser un método in vitro o in vivo. En una realización, se utiliza un anticuerpo anti-IL-18R1 para seleccionar los sujetos elegibles para la terapia con un anticuerpo anti-IL-18R1, por ejemplo en el caso de que IL- 18R1 sea un marcador biológico para la selección de pacientes.

Son trastornos ejemplares que pueden diagnosticarse utilizando un anticuerpo de la invención, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), las enfermedades inflamatorias, autoinmunológicas, la artritis reumatoide, el lupus, la soriasis o las enfermedades óseas.

En determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-IL-18R1 marcados. Entre los marcajes se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, marcajes o grupos que se detectan directamente (tales como marcajes fluorescentes, cromofóricos, electrodensos, quimioluminiscentes y radioactivos), así como grupos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo mediante una reacción enzimática o una interacción molecular. Entre los marcajes ejemplares se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los isótopos radioactivos 32P, 14C, 125I, 3H e 131I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente US nº 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, β-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacárido, por ejemplo glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con un enzima que utiliza el peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor-pigmento, tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcajes de espín, marcajes de bacteriófago, radicales libres estables y similares.

D. Formulaciones farmacéuticas Se prepararon formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-IL-18R1 tal como se ha descrito en la presente memoria mediante la mezcla de dicho anticuerpo que presenta el grado deseado de pureza con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol A. (editor), 1980), en forma de formulaciones liofilizadas o de soluciones acuosas. Los portadores farmacéuticamente aceptables son generalmente no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas y entre ellos se incluyen, aunque sin limitación: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil-amónico, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenes tales como metilparabén o propilparabén; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptido de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Zn- proteína) y/o surfactantes no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Entre los portadores farmacéuticamente aceptables ejemplares en la presente memoria se incluyen además agentes de dispersión de fármaco intersticial, tales como glucoproteínas hialuronidasa solubles activas a pH neutro (sHASEGP), por ejemplo las glucoproteínas hialuronidasa PH-20 solubles humanas, tales como rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinados sHASEGP ejemplares y métodos de utilización, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente nº US 2005/0260186 y nº US 2006/0104968. En un aspecto, se combina una sHASEGP con una o más glucosaminoglicanasas adicionales, tales como condroitinasas.

Se describen formulaciones liofilizadas ejemplares de anticuerpos en la patente US nº 6.267.958. Entre las formulaciones acuosas de anticuerpos se incluyen los indicados en la patente US nº 6.171.586 y el documento nº WO 2006/044908, incluyendo las últimas formulaciones un tampón de histidina-acetato.

La formulación en la presente memoria también puede contener más de un ingrediente activo, según resulte necesario para la indicación particular bajo tratamiento, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no presente efectos mutuos adversos. Dichos ingredientes activos se encuentran convenientemente presentes en combinación en cantidades que resultan efectivas para el propósito pretendido.

Los ingredientes activos pueden atraparse en microcápsulas preparadas mediante, por ejemplo, técnicas de coacervado o mediante polimerización interfacial, por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración coloidal de fármacos (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se dan a conocer en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol A. (editor), 1980.

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, encontrándose las matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas.

Las formulaciones que deben utilizarse para la administración in vivo son generalmente estériles. La esterilidad puede alcanzarse fácilmente mediante, por ejemplo, filtración a través de membranas de filtración estéril.

E. Métodos y composiciones terapéuticos Puede utilizarse en métodos terapéuticos cualquiera de los anticuerpos anti-IL-18R1 proporcionados en la presente memoria.

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-IL-18R1 para la utilización como medicamento. En aspectos adicionales, se proporciona un anticuerpo anti-IL-18R1 para la utilización en el tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), las enfermedades inflamatorias y autoinmunológicas, la artritis reumatoide, el lupus, la soriasis o las enfermedades óseas, u otras enfermedades mediadas por IL18R1. En determinadas realizaciones se proporciona un anticuerpo anti-IL-18R1 para la utilización en un método de tratamiento. En determinadas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-18R1 para la utilización en un método de tratamiento de un individuo que presenta enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), enfermedades inflamatorias, autoinmunológicas, artritis reumatoide, lupus, soriasis o una enfermedad ósea, que comprende la administración en el individuo de una cantidad efectiva del anticuerpo anti-IL-18R1. En una de dichas realizaciones, el método comprende además la administración en el individuo de una cantidad efectiva de por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo tal como se describe posteriormente. En realizaciones adicionales, la invención proporciona un anticuerpo anti-IL-18R1 para la utilización en el bloqueo de la interacción entre IL-18 y los receptores IL-18R1 e IL18RAP, nº de acceso Uniprot. 095256 y la inhibición de la señalización mediada por el receptor de IL-18 y la activación de la ruta de NFkappaB. La ruta de NFkappaB y su activación (señalización) se describe en, por ejemplo, Kearns J.D. y Hoffmann A., J. Biol. Chem. 284:5439-5443, 2009. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriormente indicadas preferentemente es un ser humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona la utilización de un anticuerpo anti-IL-18R1 en la fabricación o preparación de un medicamento. En una realización, el medicamento está destinado al tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), las enfermedades inflamatorias, las enfermedades autoinmunológicas, la artritis reumatoide, el lupus, la soriasis o las enfermedades óseas. En una realización adicional, el medicamento está destinado a la utilización en un método de tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), las enfermedades inflamatorias, autoinmunológicas, la artritis reumatoide, el lupus, la soriasis o las enfermedades óseas, que comprende la administración en un individuo que presenta la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), las enfermedades inflamatorias, autoinmunológicas, la artritis reumatoide, el lupus, la soriasis o las enfermedades óseas de una cantidad efectiva del medicamento. En una de dichas realizaciones, el método comprende además la administración en el individuo de una cantidad efectiva de por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo tal como se describe posteriormente. En una realización adicional, el medicamento resulta útil para bloquear la interacción entre IL-18 y los receptores IL-18R1 e IL18RAP, nº de acceso Uniprot 095256 y la inhibición de la señalización mediada por el receptor de IL-18 y la activación de la ruta de NFkappaB en un individuo. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), las enfermedades inflamatorias, las enfermedades autoinmunológicas, la artritis reumatoide, el lupus, la soriasis o las enfermedades óseas. En una realización, el método comprende la administración en un individuo que presenta dicha enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), enfermedad inflamatoria, autoinmunológica, artritis reumatoide, lupus, soriasis o enfermedad ósea, de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-IL-18R1. En una de dichas realizaciones, el método comprende además la administración en el individuo de una cantidad efectiva de por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo tal como se describe posteriormente. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.

Preferentemente, el anticuerpo según la invención bloquea la interacción entre IL-18 y los receptores IL-18R1 e IL- 18RAP, nº de acceso Uniprot 095256 e inhibe la señalización mediada por el receptor de IL-18 y la activación de la ruta de NFkappaB. Dicho anticuerpo es el anticuerpo 1G12 o el anticuerpo 2D11. En una realización, el método comprende la administración en el individuo de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-IL-18R1. En una realización, un “individuo” es un ser humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-IL-18R1 proporcionados en la presente memoria, por ejemplo para la utilización en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriormente indicados. En una realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-IL-18R1 proporcionados en la presente memoria y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-IL-18R1 proporcionados en la presente memoria y por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo tal como se indica posteriormente.

Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse solos o en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, puede coadministrarse un anticuerpo del a invención con por lo menos un agente terapéutico adicional.

Dichas terapias de combinación indicadas anteriormente comprenden la administración combinada (en la que se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones separadas), y la administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de la invención puede realizarse antes, simultáneamente y/o después de la administración del agente terapéutico adicional y/o adyuvante. Los anticuerpos de la invención también pueden utilizarse en combinación con terapia de radiación.

Un anticuerpo de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) puede administrarse mediante cualquier medio adecuado, incluyendo la administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local y la administración intralesional. Entre las infusiones parenterales se incluye la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede realizarse por cualquier vía adecuada, por ejemplo mediante inyecciones, tales como las inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Se encuentran contempladas dentro de la presente memoria diversos programas de dosificación, aunque sin limitación, las administraciones individuales o múltiples en diversos puntos del tiempo, la administración de bolo y la infusión de pulsos.

Los anticuerpos de la invención pueden formularse, dosificarse y administrarse de un modo consistente con la buena práctica médica. Entre los factores a considerar en el presente contexto se incluyen el trastorno particular bajo tratamiento, el mamífero particular bajo tratamiento, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el programa de administración y otros factores conocidos por el profesional médico. El anticuerpo opcionalmente, no necesariamente, se formula con uno o más agentes utilizados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad efectiva de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores comentados anteriormente. Estos generalmente se utilizan en las mismas dosis y por vías de administración tales como las indicadas en la presente memoria, o entre aproximadamente 1% y 99% de las dosis indicadas en la presente memoria, o en cualquier dosis y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que resulta apropiada.

Para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, la dosis apropiada de un anticuerpo de la invención (utilizado solo o en combinación con uno o más otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que debe tratarse, del tipo de anticuerpo, de la severidad y curso de la enfermedad, de si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia anterior, de la historia clínica del paciente y de la respuesta al anticuerpo, y del criterio del médico responsable. El anticuerpo se administra convenientemente en el paciente de una vez o a lo largo de una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, una dosis candidata inicial puede ser de entre aproximadamente 1 μg/kg y 15 mg/kg (por ejemplo de entre 0,1 mg/kg y 10 mg/kg) para la administración en el paciente mediante, por ejemplo, una o más administraciones separadas o mediante la infusión continua. Una dosis diaria típica puede encontrarse comprendida entre aproximadamente 1 μg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para las administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento generalmente se mantendría hasta producirse una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosis ejemplar del anticuerpo se encontraría comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 0,05 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg. De esta manera, puede administrarse en el paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ó 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis pueden administrarse intermitentemente, por ejemplo cada semana o cada tres semanas (por ejemplo de manera que el paciente reciba entre aproximadamente dos y aproximadamente veinte, o por ejemplo aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Puede administrarse una dosis de carga más alta inicial, seguido de una o más dosis inferiores. Un régimen ejemplar de dosificación comprende la administración de entre aproximadamente 4 y 10 mg/kg. Sin embargo, pueden resultar útiles otros regímenes de dosificación. Se realiza fácilmente un seguimiento del avance de dicha terapia utilizando técnicas y ensayos convencionales.

Se entiende que cualquiera de las formulaciones o métodos terapéuticos anteriormente indicados puede llevarse a cabo utilizando un inmunoconjugado de la invención en sustitución o adicionalmente a un anticuerpo anti-IL-18R1.

F. Artículos fabricados En otro aspecto de la invención se proporciona un artículo fabricado que contiene materiales que resultan útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos indicados anteriormente. El artículo fabricado comprende un recipiente y una etiqueta o impreso en el paquete o asociado al recipiente. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los recipientes pueden formarse a partir de una diversidad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que resulta, por sí misma o en combinación contra composición, efectiva para tratar, prevenir y/o diagnosticar la condición y que puede presentar una abertura de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que presenta un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o impreso en el paquete indica que la composición se utiliza para el tratamiento de la condición de elección. Además, el artículo fabricado puede comprender: (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo de la invención, y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente terapéutico adicional. El artículo fabricado en la presente realización de la invención puede comprender además un impreso en el paquete que indique que las composiciones pueden utilizarse para tratar una condición particular. Alternativamente, o adicionalmente, el artículo fabricado puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (ABPI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Se entiende que cualquiera de los artículos fabricados anteriormente indicados puede incluir un inmunoconjugado de la invención en sustitución o adicionalmente a un anticuerpo anti-IL-18R1.

III. Descripción del listado de secuencias SEC ID nº 1 región variable de cadena pesada (VH) de mAb 1G12 SEC ID nº 2 CDRH1 de cadena pesada de mAb 1G12 SEC ID nº 3 CDRH2 de cadena pesada de mAb 1G12 SEC ID nº 4 CDRH3 de cadena pesada de mAb 1G12 SEC ID nº 5 región variable de cadena ligera (VL) de mAb 1G12 SEC ID nº 6 CDRL1 de cadena ligera de mAb 1G12 SEC ID nº 7 CDRL2 de cadena ligera (variante 1), mAb 1G12 SEC ID nº 8 CDRL3 de cadena ligera, mAb 1G12 SEC ID nº 9 región variable de cadena pesada (VH) de mAb 2D11 SEC ID nº 10 CDRH1 de cadena pesada de mAb 2D11 SEC ID nº 3 CDRH2 de cadena pesada de mAb 2D11 SEC ID nº 4 CDRH3 de cadena pesada de mAb 2D11 SEC ID nº 11 región variable de cadena ligera (VL) de mAb 2D11 SEC ID nº 6 CDRL1 de cadena ligera de mAb 2D11 SEC ID nº 7 CDRL2 de cadena ligera de mAb 2D11 SEC ID nº 8 CDRL3 de cadena ligera de mAb 2D11 SEC ID nº 12 Cadena ligera kappa humana SEC ID nº 13 Cadena ligera lambda humana SEC ID nº 14 IgG1 humana (alotipo caucásico) SEC ID nº 15 IgG1 humana (alotipo afroamericano) SEC ID nº 16 IgG1 humana mutante LALA (alotipo caucásico) SEC ID nº 17 IgG4 humana SEC ID nº 18 IgG4 humana mutante SPLE SEC ID nº 19 a 28: fragmentos y fragmentos mutantes de IL-18Rα SEC ID nº 29 región variable de cadena pesada (VH) de mAb 1G12-9,6 humanizado SEC ID nº 30 CDRH1 de cadena pesada de mAb 1G12-9,6 humanizado SEC ID nº 31 CDRH2 de cadena pesada de mAb 1G12-9,6 humanizado SEC ID nº 32 CDRH3 de cadena pesada de mAb 1G12-9,6 humanizado SEC ID nº 33 región variable de cadena ligera (VL) de mAb 1G12-9,6 humanizado SEC ID nº 34 CDRL1 de cadena ligera de mAb 1G12-9,6 humanizado SEC ID nº 35 CDRL2 de cadena ligera de mAb 1G12-9,6 humanizado SEC ID nº 36 CDRL3 de cadena ligera de mAb 1G12-9,6 humanizado SEC ID nº 37 región variable de cadena pesada (VH) de mAb 1G12-10,5 humanizado SEC ID nº 38 CDRH1 de cadena pesada de mAb 1G12-10,5 humanizado SEC ID nº 39 CDRH2 de cadena pesada de mAb 1G12-10,5 humanizado SEC ID nº 40 CDRH3 de cadena pesada de mAb 1G12-10,5 humanizado SEC ID nº 41 región variable de cadena ligera (VL) de mAb 1G12-10,5 humanizado SEC ID nº 42 CDRL1 de cadena ligera de mAb 1G12-10,5 humanizado SEC ID nº 43 CDRL2 de cadena ligera de mAb 1G12-10,5 humanizado SEC ID nº 44 CDRL3 de cadena ligera de mAb 1G12-10,5 humanizado SEC ID nº 45 región variable de cadena pesada (VH) de mAb 1G12-10,6 humanizado SEC ID nº 46 CDRH1 de cadena pesada de mAb 1G12-10,6 humanizado SEC ID nº 47 CDRH2 de cadena pesada de mAb 1G12-10,6 humanizado SEC ID nº 48 CDRH3 de cadena pesada de mAb 1G12-10,6 humanizado SEC ID nº 49 región variable de cadena ligera (VL) de mAb 1G12-10,6 humanizado SEC ID nº 50 CDRL1 de cadena ligera de mAb 1G12-10,6 humanizado SEC ID nº 51 CDRL2 de cadena ligera de mAb 1G12-10,6 humanizado SEC ID nº 52 CDRL3 de cadena ligera de mAb 1G12-10,6 humanizado SEC ID nº 53 región variable de cadena pesada (VH) de mAb 1G12-11,6 humanizado SEC ID nº 54 CDRH1 de cadena pesada de mAb 1G12-11,6 humanizado SEC ID nº 55 CDRH2 de cadena pesada de mAb 1G12-11,6 humanizado SEC ID nº 56 CDRH3 de cadena pesada de mAb 1G12-11,6 humanizado SEC ID nº 57 región variable de cadena ligera (VL) de mAb 1G12-11,6 humanizado SEC ID nº 58 CDRL1 de cadena ligera de mAb 1G12-11,6 humanizado SEC ID nº 59 CDRL2 de cadena ligera de mAb 1G12-11,6 humanizado SEC ID nº 60 CDRL3 de cadena ligera de mAb 1G12-11,6 humanizado SEC ID nº 61 región variable de cadena pesada (VH) de mAb 1G12-12.6 humanizado SEC ID nº 62 CDRH1 de cadena pesada de mAb 1G12-12.6 humanizado SEC ID nº 63 CDRH2 de cadena pesada de mAb 1G12-12.6 humanizado SEC ID nº 64 CDRH3 de cadena pesada de mAb 1G12-12.6 humanizado SEC ID nº 65 región variable de cadena ligera (VL) de mAb 1G12-12.6 humanizado SEC ID nº 66 CDRL1 de cadena ligera de mAb 1G12-12.6 humanizado SEC ID nº 67 CDRL2 de cadena ligera de mAb 1G12-12.6 humanizado SEC ID nº 68 CDRL3 de cadena ligera de mAb 1G12-12.6 humanizado SEC ID nº 69 secuencia de consenso de CDRL1 de cadena ligera SEC ID nº 70 secuencia de consenso de CDRH1 de cadena ligera SEC ID nº 71 secuencia de consenso de CDRH2 de cadena ligera SEC ID nº 72 IL-18R1 humana (IL-18Rα)

EJEMPLOS

A continuación se proporcionan ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que pueden ponerse en práctica diversas otras realizaciones, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Aunque la invención anteriormente proporcionada ha sido descrita en cierto detalle a título ilustrativo y ejemplar con fines de claridad de comprensión, las descripciones y ejemplos no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención. Las exposiciones de toda la literatura de patentes y científica citada en la presente memoria se incorporan expresamente en su totalidad como referencia.

Ejemplo 1 Inmunización Se utilizaron ratones NMRI de 8 a 10 semanas de edad para la inmunización. Se llevó a cabo la inmunización mediante vacunación de ADN. Brevemente, se inyectaron intradérmicamente 30 μl en agua de plásmido de ADN que expresaba ambas cadenas (alfa y beta) del receptor de IL-18 humano en el lomo de ratones anestesiados con isoflurano inmediatamente antes de la electroporación. La inmunización se llevó a cabo cada 2 semanas sin ningún adyuvante. Los ratones se sangraron periódicamente para determinar si se había desarrollado una respuesta de anticuerpos correcta. Con este fin se extrajo sangre del seno retroorbital y se sometió a ensayo suero en un ELISA específico para IL-18Rα, así como en un ensayo de KG-1/IFNgamma funcional y en un Biacore para la selección del animal apropiado para la fusión. Los ratones recibieron un refuerzo intravenoso de antígeno 4 días antes de la recolección de los bazos para activar las células B e incrementar el número de células positivas para antígeno situadas en el bazo. Se recolectaron bazos de ratones adecuadamente inmunizados inmediatamente antes de la fusión con células de mieloma.

Ejemplo 2 Inhibición de la unión de IL-18_hu a complejo de IL-18Rαβ (ELISA) El ensayo se llevó a cabo en placas de microtitulación de 384 pocillos a temperatura ambiente (TA). Tras cada etapa de incubación, las placas se lavaron 3 veces con PBST (solución salina tamponada con fosfato Tween®-20). Al inicio, las placas se recubrieron con 0,5 μg/ml de fragmento Fc de cabra anti-IgG humana (Jackson Imm. Res., US, nº de cat. 109-006-170) durante por lo menos 2 horas (h). A continuación, los pocillos se bloquearon con PBS suplementado con Tween®-20 al 0,1% y BSA al 2% (Roche Diagnostics GmbH, DE) durante 1 hora. Se capturaron 0,2 μg/ml de quimera IL-18Rα:Fc humana recombinante (R&D Systems, Reino Unido, nº de cat. 816-LR) durante 1 hora. Las diluciones de los anticuerpos purificados en PBS con BSA al 0,5% y Tween®-20 al 0,05% se incubaron con la proteína receptora durante 1 hora. Se añadieron IL-18 humana biotinilada (MBL International, US, nº de cat. B003- 5) y 0,2 μg/ml de IL-18Rβ (R&D Systems, Reino Unido, nº de cat. 118-AP) durante una hora adicional para construir el complejo trimérico. La IL-18 se biotiniló con sulfo-NHS-LC-biotina (Thermo Scientific Pierce, US, nº de cat. 21327) siguiendo el protocolo del fabricante y se purificó utilizando la columna desaladora de centrifugación ZebaTM (Thermo Scientific Pierce, US, nº de cat. 89889). La unión de la IL-18 biotinilada al complejo se detectó con estreptavidina- HRP diluido a 1:2.000 (Roche Diagnostics GmbH, DE, nº de cat. 11089153001). Tras 1 hora, las placas se lavaron 6 veces con PBST y se revelaron con solución de sustrato de POD BM blue® recién preparada (BM blue®: 3,3’,5,5’- tetrametilbencidina, Roche Diagnostics GmbH, DE, nº de cat. 11484281001) durante 30 minutos a TA. Se midió la absorbancia a 370 nm. Se definió el control negativo con ausencia de proteína IL-18Rα y el control positivo como la presencia de todos los componentes aunque sin anticuerpo. Para la comparación se utilizó el clon 70625 de mAb murino anti-IL-18Rα humano (R&D Systems, nº MAB840). Se muestran los resultados en la Tabla 1: Tabla 1: Anticuerpo IC50 (μg/ml) IC50 (nM) F20.1G12 0,022 0,15 F20.2D11 0,029 0,19 Mab 840 0,044 0,29 IL-18Rß: proteína accesoria del receptor de la IL-18 humana, IL-18RAP (Uniprot nº de acceso 095256).

Ejemplo 3 producción de IFNγ inducida por IL-18 por parte de células KG-1 humanas a) Reactivos: línea celular KG1 (ATCC nº CCL246) Medio de cultivo: RPMI 1640 complementado con FCS al 10% con Pen/Strep IL-18 humana recombinante (RnD Systems, nº B003-2) juego ELISA de IFNγ humana BD OptEIA (BD, nº 555142) TNFalfa_rh (R&D, nº de cat. 210-TA).

b) Procedimiento: Se cultivaron células KG-1 en medio RPMI 1640 complementado con FCS al 10% y Pen/Strep en una mezcla de 5% CO2/95% aire a 37ºC. Se subcultivaron las células al alcanzar una densidad de 2x106 células/ml y se diluyeron hasta una densidad de 4x105 células/ml. Para determinar la concentración efectiva de IL-18, se resuspendieron las células KG-1 a una densidad de 1x106 células/ml y 100 μl/pocillo en una placa de 96 pocillos en medio de crecimiento con diversas dosis de IL-18_rh (0 a 200 ng/ml); se recogieron los sobrenadantes para el análisis de ELISA de IFNγ. Se preincubaron los anticuerpos con células KG-1 a una densidad de 1x106 células/ml y 100 μl/pocillo en una placa de 96 pocillos en medio de crecimiento durante 60 minutos (concentraciones finales de entre 1 ng/ml y 10 μg/ml), se añadieron IL-18_rh (10 ng/ml) y TNF-alfa (5 ng/ml) al cultivo y se incubaron durante 16 a 20 horas a 37ºC. Los sobrenadantes se recogieron para el análisis de ELISA de IFNγ. Se estimularon las células KG-1 durante la noche con 10 ng/ml de TNFalfa para inducir la expresión de IL18R. A continuación se incubaron las células con anticuerpos anti-IL18R durante diferentes periodos de tiempo, seguido de: a) la detección del anticuerpo unido, o b) la determinación de la expresión superficial de IL18R. Se muestran los resultados en la Tabla 2. Por ejemplo, mAb 840 anti-IL-18Ra (R&D Systems), mostró un valor de IC50 [pM] de 798.

Tabla 2: Anticuerpo IC50 [pM] mAb 1G12 27 mAb 2D11 43 Ejemplo 4 Determinación de la afinidad de los anticuerpos anti-IL-18Rα para el IL-18Rα_h de longitud completa (quimera de Fc_h) Instrumento: BIACORE® A100 Chip: CM3 (GE Healthcare BR-1006-36) Acoplamiento: de aminas Tampón: 1x PBS (10x PBS, Ambion nº de cat. AM9625), pH 7,4, 37 Para las mediciones de afinidad, se acoplaron 10 μg/ml de anticuerpos anti-Fcγ de ratón (de cabra, ℃Jackson ImmunoResearch JIR115-005-071) ó 10 μg/ml de anticuerpos anti-Fcγ humana (de cabra, Jackson ImmunoResearch JIR109-005-098) a la superficie de un chip para la captura de los anticuerpos contra IL-18Rα_h.

Se añadió IL-18Rα_h (quimera de Fc_h, R&D Systems, nº 816-LR) a diversas concentraciones en una solución que contenía BSA al 0,1% (Roche, ref. nº 10238040001). Se midió la asociación mediante una inyección de ILR-18Rα_h de 1,5 minutos a 37ºC; se midió la disociación mediante lavado de la superficie del chip con tampón durante 10 minutos a 37ºC. Para el cálculo de la KD aparente y otros parámetros cinéticos, se utilizó el modelo 1:1 de Langmuir.

Se muestran los resultados en la Tabla 3.

Tabla 3: Datos de afinidad medidos mediante RPS (BIACORE® T100) a 37ºC Anticuerpo KD aprox. (M) Ka (1/Ms) Kd (1/s) t1/2 (min.) mAb 1G12 2,7x10-11 8,2x106 2,0x10-4 58 mAb 2D11 2,7x10-11 7,0 x106 1,9x10-4 62 MS 6,4x10-11 5,1 x106 3,0x10-4 39 MS: anticuerpo de secuencia SEC ID nº 3 y 4 del documento nº WO 2007/096396.

Ejemplo 5a Competición cruzada mediante la utilización de RPS Instrumento: BIACORE® A100 Chip: CM5 (Biacore BR-1006-68) Acoplamiento: de aminas Tampón: 1x PBS (10x PBS, Ambion nº de cat. AM9625), pH 7,4, 25 Para los ensayos de mapeado de epítopos mediante la competición cruzada, se acoplaron 30 ℃ μg/ml de anticuerpos anti-Fcγ de ratón o anticuerpos anti-Fcγ humanos (de cabra, Jackson ImmunoResearch, nº de cat. 115-005-071 y nº de cat. 109-005-098) a la superficie del chip sensor para la presentación del anticuerpo contra IL-18Rα_h. Tras la captura de 1 a 6 μg/ml de anticuerpos monoclonales anti-IL-18Rα_h, se bloqueó la capacidad de unión libre de los anticuerpos de captura durante 4 minutos con 250 μg/ml de inmunoglobulinas de ratón o humanas (Jackson ImmunoResearch 015-000-003 ó 009-000-003), seguido de la inyección de 2,5 μg/ml de IL-18Rα_h (quimera de Fc_h, R&D Systems, nº de cat. 816-LR) durante 2 minutos. Se analizó la unión de 0,6 a 3 μg/ml de segundo anticuerpo anti-IL-18Rα_h mediante la inyección durante 2 minutos; se midió la disociación mediante lavado con tampón durante 2 minutos. El ensayo y las mediciones se llevaron a cabo a 25ºC. Se referenció la unión específica del segundo anticuerpo anti-IL-18Rα_h respecto a la transferencia realizada con el mismo diseño de chip aunque únicamente sin la inyección de IL-18R_h. Los datos de competición cruzada se han calculado en porcentaje (%) de la respuesta de unión esperada del segundo anticuerpo anti-IL-18Rα_h. La expresión “porcentaje (%) de la respuesta de unión esperada” para la unión del segundo anticuerpo se calculó como “100 * respuesta relativa (estabilidad_muestra_tardía)/rMax”, en donde rMax se calcula como “respuesta relativa de antígeno (estabilidad_general_tardía) * peso molecular del anticuerpo/peso molecular del antígeno”, tal como se describe en las instrucciones de mapeado de epítopos del Biacore (para el instrumento BIACORE® A100). Se muestran los resultados en la Tabla 4a.

Tabla 4a: Porcentaje de la respuesta de unión esperada para el anticuerpo 2 Anticuerpo 1 Anticuerpo 2 mAb 1G12 mAb 2D11 EM mAb 1G12 52 mAb 2D11 48 EM 76 76 EM: anticuerpo de secuencia SEC ID nº 3 y 4 del documento nº WO 2007/096396.

La unión entre 1G12 y 2D11 no era detectable, debido a que se unen dentro de la misma agrupación de epítopos, mientras que la unión de "MS" era detectable (listada en (%) de respuesta de unión esperada del segundo anticuerpo anti-IL-18Rα_h), demostrando que “MS” se une a una agrupación de epítopos diferente de 1G12 y 2D11.

Además, la unión de “MS” no era detectable en el caso de que “MS” se encontrase preunido.

En un segundo experimento, se comparó la unión de los anticuerpos según la invención con el mAb 840 anti-IL- 18Rα (R&D Systems). Se muestran los resultados en la Tabla 4a.

Tabla 4a: Porcentaje de la respuesta de unión esperada para el anticuerpo 2 Anticuerpo 1 Anticuerpo 2 F20.1G12 F20.2D11 mAb840 mAb1G12 97 mAb2D11 97 mAb840 119 121 13 La unión entre 1G12 y 2D11 no era detectable, debido a que se unen dentro del mismo epítopo, mientras que mAb 840 se une a un epítopo diferente que 1G12 y que 2D11.

Ejemplo 6 a) Ensayo FACS de células HEK293 transfectadas con IL-18Rα/IL-18Rβ humanas: Se transfectaron 106 células HEK293 con un plásmido que expresaba IL-18Ralfa + IL-18Rβ humanas. Las células transfectadas se incubaron durante 1 día. Se incubaron 1x105 células sobre hielo en tampón PBS + FCS al 2% y se tiñeron con anticuerpo de IL-18Rα (1 μg/ml). A modo de anticuerpo secundario se añadió anti-IgG1 de ratón-PE de R&D Systems (F0102B) en una dilución 1:20, y a modo de isotipo de control, se utilizó IgG1 de ratón de BD Pharmingen (nº 557273) a una concentración de 1 μg/ml. Los resultados en la fig. 1 muestran que los anticuerpos 1G12 (F20.1G12) y 2D11 (F20.2D11) se unen ambos a células transfectadas y que expresan las subunidades IL18Ralfa + IL-18Rβ humanas.

b) Ensayo FACS de células HEK293 transfectadas con IL-18Rα/IL-18Rβ de Cynomolgus: Se transfectaron 106 células HEK293 con un plásmido que expresaba IL-18Ralfa + IL-18Rβ de mono Cynomolgus. Las células transfectadas se incubaron durante 1 día. Se incubaron 105 células sobre hielo en tampón de PBS + FCS al 2% y se tiñeron con anticuerpo de IL-18Rα a una concentración de 1 μg/ml. A modo de anticuerpo secundario se añadió anti-IgG1 de ratón-PE de R&D Systems (F0102B) en una dilución 1:20, y a modo de isotipo de control, se utilizó IgG1 de ratón de BD Pharmingen (nº 557273) a una concentración de 1 μg/ml. Los resultados en la fig. 2 muestran que los anticuerpos 1G12 (F20.1G12) y 2D11 (F20.2D11) se unen ambos a células transfectadas y que expresan las subunidades IL18Ralfa + IL-18Rβ de Cynomolgus.

Ejemplo 7 ELISA celular de células CHO que expresan IL-18Ralfa de mono Cynomolgus o IL-18Ralfa y beta de mono Cynomolgus Las líneas celulares recombinantes CHO-K1 que expresaban IL-18Rα de mono Cynomolgus o IL-18Rα+β de mono Cynomolgus se tiñeron con los anticuerpos mAb_IL-18R en una ELISA celular. Los controles eran células CHO-K1 no transfectadas. Las células se cultivaron en medio F-12 (GIBCO) con Glutamax-1 (GIBCO nº de cat. 31331-028) + FCS al 10% (PAN nº de cat. 2802-P920707). Para el cultivo de las líneas celulares recombinantes, se añadieron 250 μg/ml de G418 (geneticina, GIBCO, nº de cat. 10131-019). A modo de anticuerpo de control, se añadió anticuerpo mAb840 anti-hIL-18Ralfa (IgG1 monoclonal de ratón de R&D Systems, nº de cat. mAb 840) y a modo de anticuerpo de detección se añadió conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (H+L)-HRP (BioRad). Para la realización del ensayo, el día 1, se sembraron 2x104 células CHO_CynoIL-18Rα, CHO_CynoIL-18Rα+β o CHO en 50 μl de F- 12/pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 37ºC. El día 2, se añadieron 50 μl de sobrenadante o de anticuerpo purificado (2X) diluido en medio ó 50 μl de sobrenadante de hibridoma, y se incubó durante 2 horas a 4ºC. Se aspiró el sobrenadante y se añadieron 100 μl/pocillo de solución de fijación de glutaraldehído (solución madre al 25%, grado EM; concentración final=al 0,05% en PBS) y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Para el lavado, se añadieron y sacaron 200 μl de PBS/pocillo 2 veces. Se añadieron 50 μl de anticuerpo de detección de ELISA diluido en reactivo de bloqueo de ELISA (reactivo madre de bloqueo de ELISA diluido 1:10 en PBS). Se añadió conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (H y L)-HRP diluido 1:2.000 y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador. Se aspiró la solución y se llevó a cabo el lavado 3 veces con 200 μl de PBS. Se añadieron 50 μl de TMB durante 7 a 10 minutos (hasta desarrollarse el color azul). Se detuvo la reacción mediante la adición de 25 μl de H2SO4 1 M. Se midieron las MTP a 450 nm-620 nm utilizando un lector de ELISA (TECAN). Se muestran los resultados en la Tabla 5. No se observó unión con las células no transformadas.

Tabla 5: Anticuerpo CHO CyIL-18Rα EC50 (ng/ml) CHO CyIL-18Rα+β EC50 (ng/ml) mAb 1G12 18,58 15,01 ‘Reg’ 185,44 139,46 ‘MS’ ≥ 1000,00 ≥1000,00 Resulta importante para la investigación toxicológica y para el ensayo de FC/FD que el anticuerpo reconozca el IL- 18Rα Cyno con una EC50 similar a la de su unión al IL-18Rα humano.

Ejemplo 8 Investigación de la producción de IFNγ inducida por IL-18 en PBMC humanas La IL-18 presenta una función biológica en las células asesinas naturales (NK) y en la activación de las células TH1, por ejemplo mediante la inducción del interferón gamma (IFNγ) en las células CD4+ y en otras células T, células B, células NK y monocitos. IL-18 también sinergiza con IL-12 en la inducción de IFNγ en células T humanas (sin unión del TCR) de manera similar a IL-1β (Tominaga K. et al., Int. Immunol. 12:151-160, 2000). En este caso el mecanismo está asociado a la expresión inducida por IL-12 de la cadena IL-18Rα, tal como se describe para las células TH1 pero no para las TH2.Para evaluar el impacto funcional de los mAb anti-IL-18, tanto contra el receptor como contra el ligando, se aislaron células mononucleares sanguíneas periféricas mediante la técnica de Ficoll-Paque. Se precultivaron 2x105 células/pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano (volumen: 200 μl) en presencia de 5 ng/ml de IL-12 (Sigma) durante 3 días. A continuación, se añadió IL-18 (MBL, http://www.mblintl.com/) a una concentración final de 10 ng/ml durante 3 días adicionales. En este punto, para bloquear el receptor o neutralizar el ligando, se añadieron mAb anti-IL18R a una concentración final de entre 0,01 y 0,5/1,0 μg/ml. Tras un total de 6 días, se analizó la producción de IFNγ en sobrenadante mediante ELISA. Se muestran los resultados en la Tabla 6.

Tabla 6: Anticuerpo IC50 [ng/ml] mAb 1G12 0,76 ± 0,5 mAb 2D11 1,71 ± 0,3 Reg 2,3 ± 3,2 EM 2,6 ± 2,4 Ejemplo 9 Unión de anticuerpos a IL-18Rα_hu y a otras proteínas de la familia de receptores de IL-1 (ELISA) Se llevó a cabo el ensayo en placas de microtitulación de 384 pocillos (MaxiSorpTM, Thermo Scientific Nunc, DK, nº de cat. 464718) a TA. Tras cada etapa de incubación, se lavaron las placas 3 veces con PBST. Al inicio, las placas se recubrieron con 0,5 μg/ml de fragmento Fc de cabra anti-IgG humana (Jackson Imm. Res., US, nº de cat. 109- 006-170) durante por lo menos 2 horas (h). A continuación, se bloquearon los pocillos con PBS complementado con Tween®-20 al 0,2% y BSA al 2% (Roche Diagnostics GmbH, DE) durante 1 h. Se capturaron 0,2 μg/ml de quimera de IL18Rα-Fc recombinante humana (R&D Systems, Reino Unido, nº de cat. 816-LR) en una placa durante 1 h. Para el ensayo de la unión de los anticuerpos a otras proteínas de la familia de receptores de IL-1, se conjugaron 0,2 μg/ml de las proteínas humanas recombinantes siguientes a Fc humana (Fc_h): IL-1RI_rh/Fc_h (R&D Systems, Reino Unido, nº de cat. 269-1R) IL-1sRII_rh/Fc_h (R&D Systems, Reino Unido, nº de cat. 263-2R) IL-1R3_rh/Fc_h (R&D Systems, Reino Unido, nº de cat. 676-CP) IL-2Rα_rh/Fc_h (R&D Systems, Reino Unido, nº de cat. 1020-RL) IL-7Rα_rh/Fc_h (R&D Systems, Reino Unido, nº de cat. 306-IR) IL-15R_rh/Fc_h (R&D Systems, Reino Unido, nº de cat. 147-IR) ST-2_rh/Fc_h (R&D Systems, Reino Unido, nº de cat. 523-ST) Tras el lavado, las diluciones de la placa de anticuerpos purificados en PBS con BSA al 0,05% y Tween®-20 al 0,2% se incubaron con las proteínas receptoras durante 1 h. Se detectó la unión de los anticuerpos con 1: conjugados de peroxidasa de rábano picante (HRP) diluidos 1:2.000 de anticuerpo anti-IgG de ratón (GE Healthcare, Reino Unido, nº de cat. NA9310V). Tras 1 hora, las placas se lavaron 6 veces con PBST y se revelaron con solución de sustrato de POD BM blue® recién preparada (BM blue®: 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina, Roche Diagnostics GmbH, DE, nº de cat. 11484281001) durante 30 minutos a TA. Se midió la absorbancia a 370 nm. Se corrigieron los valores para el control sin anticuerpo. Se muestran los resultados en la Tabla 7.

Tabla 7: (“/IL-1RI_rh” se refiere a “IL-1RI_rh/Fc_h”, etc.) IL- IL- IL- IL- IL- IL- Anticuerpo IL-1RI_rh 1sRII_rh 1R3_rh 2Rα_rh 7Rα_rh 15R_rh ST-2_rh 18Rα_rh mAb 1G12 0,01 -0,03 0,00 -0,01 -0,01 0,04 -0,01 2,43 mAb 2D11 0,02 -0,05 0,02 0,02 -0,01 0,19 0,02 2,56 Ejemplo 10 Internalización de receptores Se estimularon las células KG-1 durante la noche con 10 ng/ml de TNFalfa para inducir la expresión de IL18R. A continuación se incubaron las células con anticuerpos anti-IL18R durante diferentes periodos de tiempo, seguido de: a) la detección del anticuerpo unido, o b) la determinación de la expresión superficial de IL18R. Ninguno de los anticuerpos sometidos a ensayo según la invención (2D11, 1G12) indujeron la internalización o regulación negativa de receptores.

Ejemplo 11 Ensayo de TH1 humana Se aislaron células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) a partir de voluntarios sanos utilizando un gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque. Tras el lavado de las células con RPMI se resuspendieron en PBS, pH 7,2, con BSA al 0,5% y EDTA 2 mM. Se aislaron las células T de PBMC utilizando el kit de aislamiento Pan de células T (Miltenyi Biotec) y la separación magnética con un separador AutoMACSTM. Las células T enriquecidas se lavaron 3 veces con RPMI 1640 (complementado con FCS al 10%, 2-mercaptoetanol, L-glutamina, tampón HEPES, piruvato sódico y Pen/Strep), se resuspendieron y se sembraron a una densidad de 1x106 células/ml en placas de 6 pocillos de fondo redondo recubiertas con 2 μg/ml de anticuerpo anti-CD3, se incubaron durante 4 días a 37ºC con 1 μg/ml anticuerpo anti-CD28 soluble (BD Biosciences), 10 ng/ml de IFN-γ, 30 ng/ml de IL-12 y 10 μg/ml de anticuerpo anti-IL-4 (Peprotech). A continuación, las células se lavaron con RPMI completo 2 veces y después se dejaron en reposo a una densidad de 2x106 células/ml en RPMI completo con IL-2 recombinante (50 unidades/ml). Las células se trataron posteriormente con Ab anti-IL-18Rα diluido en serie o Ab de isotipo de control (0 a 1 μg/ml) durante 30 minutos, después se reestimularon con 10 ng/ml de IL-18, 2 ng/ml de IL-12 (Peprotech), a una densidad de 1x105 células por pocillo, se cultivaron en placas de 96 pocillos de fondo redondo a 37ºC bajo 5% de CO2 durante la noche.

Se recogieron los sobrenadantes para el análisis de ELISA de IFN-γ utilizando el kit ELISA de IFN-γ BD OptEIA (nº de cat. 555142). (BD Biosciences). Se leyó la absorbancia utilizando un lector de microplacas Spectromax y se analizaron los datos utilizando PRISM (software GraphPad). Se muestran los resultados en la Tabla 8a.

Tabla 8a: Anticuerpo IC90 del ensayo de TH1 humana [pM] mAb1G12 76,2 mAb2D11 87,1 ’MS’ 2914,5 Reg 2832,0 Los desequilibrios de Th1/Tc1 y de Th2/Tc2 participan en la patogénesis de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC); las células Th1/Tc1 expresan un nivel elevado de IL-18Rα y la función de las células T periféricas se correlaciona con la severidad de la EPOC (Zhu X. et al., J. Immunol. 182:3270-3277, 2009; Freeman C.M. et al., J. Immunol. 184:6504-6513, 2010; Shirai T. et al., Allergol. Int. 59:75-82, 2010). Dicho ensayo se centra en las células T, en el que éstas son activadas y se cultivan en Th1 y expresan un nivel elevado de IL-18Rα; por lo tanto, dicho ensayo requiere la máxima cantidad de Ab anti-IL-18Rα para la neutralización. Los anticuerpos según la invención muestran valores de IC90 mejorados en dicho ensayo de TH1 humana y por lo tanto, son compuestos valiosos para el tratamiento de las enfermedades dependientes de TH1.

En un segundo experimento, se determinaron los valores de IC90 en dicho ensayo de TH1 humanas para los anticuerpos humanizados. Se muestran los resultados en la Tabla 8b.

Tabla 8b: Anticuerpo IC90 del ensayo de TH1 humanas [pM] mAb1G12-9.6 148,4 mAb1G12-10.5 283,2 mAb1G12-10.6 93,5 mAb1G12-11.6 77,0 mAb1G12-12.6 399,4 ’MS’ 1431,57 Reg 2361,87 Además, los anticuerpos humanizados según la invención muestran valores de IC90 mejorados en dicho ensayo de TH1 humanas y por lo tanto son compuestos valiosos para el tratamiento de dichas enfermedades.

Ejemplo 12 Descripción del ensayo de sangre completa de la COPD primaria humana Se recogió sangre periférica de pacientes sanos no fumadores y de pacientes con EPOC (estadio Gold II-IV) en tubos con heparina sódica, se trataron con anticuerpo anti-IL-18Rα diluido en serie o con Ab de isotipo de control (0 a 0,5 μg/ml) durante 30 minutos y después se estimularon con 10 ng/ml de IL-18 y 2 ng/ml de IL-12, en placas de 96 pocillos a 37ºC bajo 5% de CO2 durante la noche. Se peletizaron las células y se recogieron los sobrenadantes para el análisis de ELISA de IFN gamma utilizando el kit ELISA de IFN-gamma humano BD OptEIA (nº de cat. 555142). (BD Biosciences). Se leyó la absorbancia utilizando un lector de microplacas Spectromax y se analizaron los datos utilizando PRISM (software GraphPad). Se muestran los resultados en la Tabla 9.

Tabla 9: IC90 del ensayo de IC90 del ensayo de transf.

Anticuerpo transf. western western humano de humano de pacientes pacientes no fumadores con EPOC [pM] sanos [pM] mAb1G12 42,1 12,2 mAb2D11 - 19,2 ’MS’ - 33,0 ’Reg’ - 21,6 Ejemplo 13 Unión de mAb 1G12 y mAb 2D11 a variantes de IL-18R Para la investigación del sitio de unión de anticuerpo, se clonó y se expresó IL-18Rα en forma de proteína de fusión de Fc (bisagra de IgG1 humana hasta CH3). IL-18Rα está compuesto de 3 dominios de tipo Ig: D1, D2 y D3 (Swiss Prot. nº de acc. Q13478). De esta manera, se generaron varias variantes y mutantes y se sometió a ensayo la unión residual de las Abs 1G12 y 2D11. Se introdujeron mutaciones mediante el intercambio de secuencias del IL-18Rα humana y secuencias correspondientes de IL-18Rα de ratón. Se llevaron a cabo deleciones mediante la clonación y expresión separadas de dominios en forma de proteínas de fusión de Fc humana. Además, se clonó IL-18Rα de Cynomolgus en forma de proteína de fusión de Fc humana. Se muestran los resultados en la Tabla 8. La unión de anticuerpos a diferentes variantes de IL-18Rα se midió mediante resonancia de plasmón superficial (RPS) utilizando un instrumento BIAcore® 3000 (GE Healtchare) a 25ºC. Se llevó a cabo un acoplamiento de aminas de aproximadamente 500 unidades de resonancia (UR) de un sistema de captura (que capturaba mAb específico para la IgG humana, Jackson ImmunoResearch/109-005/098) en un chip CM3 a pH 5,0 utilizando un kit de acoplamiento de aminas suministrado por GE Healthcare. Para el análisis, se capturaron diferentes variantes de IL18Rα etiquetadas con Fc humanas mediante la inyección de una solución 10 μg/ml durante 2 minutos a un caudal de 10 μl/minuto. Se bloqueó el exceso de sitios de unión mediante la inyección de una mezcla de Fc humanas a una concentración de 1,25 μM (Biodesign, nº 50175). A continuación, se inyectó el anticuerpo que debía someterse a ensayo, a una concentración de 0,2 μg/ml durante 3 minutos a un caudal de 10 μl/minuto. Se realizó un seguimiento de la etapa de disociación durante un máximo de 5 minutos y se indujo mediante el cambio de solución de muestra a tampón de migración. En el caso del ensayo de los ligandos naturales IL-18 y IL18Rβ, se inyectó una mezcla de ambas proteínas a una concentración de 100 nM tal como se ha indicado anteriormente para un anticuerpo. Se regeneró la superficie mediante un lavado de 1 minuto con una solución de ácido fosfórico 100 mM seguido de un lavado de 1 minuto con 5 ml de NaOH 5 mM a un caudal de 10 μl/minuto. Se corrigieron las diferencias mayores de índice refractivo mediante la sustracción de la respuesta procedente de una superficie con acoplamiento de un blanco. También se sustrajeron las inyecciones de blanco (=doble referenciado) Las variantes de IL18Rα que se unen a anticuerpos comparables al IL18Rα de tipo salvaje no influyen sobre la unión de dichos anticuerpos y por lo tanto se concluye que las mutaciones insertadas/modificadas no contribuyen a la unión (marcadas con + en la Tabla 7). La unión influida se refiere a que la señal de unión se ha reducido en 20% a 50% en comparación con la señal de unión observada con el tipo salvaje. Una unión débil se refiere a una unión clara 10% superior a la señal pero inferior en un 50% a la descrita para el receptor de tipo salvaje (indicado como 0). En el caso de que no se detecte unión, se señala con – en la Tabla 10.

Mutaciones y variantes de IL-18Rα_sh:Fc 1. Tipo salvaje IL-18Rα_sh:Fc de tipo salvaje 2. Cyno IL-18Rα:Fc de Cynomolgus 3. D3 Deleción D1/D2; D3 residual 4. D1-1 Mutación D1 SRIAL a PRVTF 5. D1-2 Mutación D1 MKNYTQK a VGNDRRN 6. D2-1 Mutación D2: QTLVNSTS a EELIQDTW 7. D2-2 Mutación D2: NPTIKKN a TPRILKD 8. D2-3 Mutación D2: HFLHHNGKLF a FSVHHNGTRY Tabla 10: 1G12 2D11 Reg EM IL-18 / IL-18Rβ (control) 1. WT + + + + + 2. Cyno + + + + + 3. D3 - - + + 4. D1-1 + + + + + 5. D1-2 + + + + + 6. D2-1 + + n.d.

n.d.

+ 7. D2-2 + + n.d.

n.d.

+ 8. D2-3 + + n.d.

n.d.

+ Leyenda: + = unión +/-= unión reducida 0 = unión débil -= sin unión detectable Ejemplo 14 Ensayo de unión de péptidos IL-18R Se investigó la unión de anticuerpos a los péptidos indicados como SEC ID nº 5 y 6 en el documento nº US 2008/0063644. Estos péptidos se biotinilaron en el extremo N-terminal y se sondearon para la unión mediante RPS.

Se midió la unión de anticuerpos a dichos péptidos mediante resonancia de plasmón superficial (RPS) utilizando un instrumento BIAcore® 3000 (GE Healthcare) a 25ºC y HBS-P+ como tampón de migración y de dilución. Los péptidos biotinilados se inmovilizaron en un chip SA mediante la inyección de varios pulsos (60 segundos) de una solución de péptidos 10 nM rindiendo una respuesta de 40 UR. La superficie de referencia, así como las superficies recubiertas, se desactivaron mediante la inyección de biotina libre a una concentración de 1 μM. Para el análisis, el anticuerpo que debía analizarse se inyectó a una concentración de 100 nM durante 3 min. a un caudal de 10 μl/min. Se realizó un seguimiento de la etapa de disociación durante un máximo de 2,5 min. y se indujo mediante el intercambio de la solución de muestra por solución de migración. Se corrigieron las diferencias mayores del índice refractivo mediante sustracción de la respuesta obtenida de una superficie con acoplamiento de un blanco. También se sustrajeron las inyecciones de blanco (=doble referenciado) En el caso del anticuerpo mAb 1G12 no pudo detectarse unión a dichos péptidos.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Anticuerpos contra IL-18R1 y usos de los mismos <130> 26956 WO <150> EP 10174039.7 <151> 2010-08-25 <160> 72 <170> PatentIn versión 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 <210> 4<211> 12<212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 <210> 5 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 <210> 9 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 <210> 11 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 <210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 12 <210> 13 <211> 105 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 13 <210> 14 <211> 330 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 14 <210> 16 <211> 330 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 16 <210> 18 <211> 327 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 18 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 <210> 29 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> región variable de cadena pesada (VH) de mAb humanizado mAb 1G12-9.6 <400> 29 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH1 de cadena pesada de mAb humanizado 1G12-9.6 <400> 30 <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH2 de cadena pesada de mAb humanizado 1G12-9.6 <400> 31 <210> 32 <211> 12 <212> PRT<213> Artificial <220> <223> CDRH3 de cadena pesada de mAb humanizado 1G12-9.6 <400> 32 <210> 33 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> región variable de cadena ligera (VL) de mAb humanizado1G12-9.6 <400> 33 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL1 de cadena ligera de mAb humanizado 1G12-9.6 <400> 34 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL2 de cadena ligera de mAb humanizado 1G12-9.6 <400> 35 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL3 de cadena ligera de mAb humanizado 1G12-9.6 <400> 36 <210> 37 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> región variable de cadena pesada (VH) de mAb humanizado 1G12-10.5 <400> 37 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH1 de cadena pesada de mAb humanizado 1G12-10.5 <400> 38 <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH2 de cadena pesada de mAb humanizado 1G12-10.5 <400> 39 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH3 de cadena pesada de mAb humanizado 1G12-10.5 <400> 40 <210> 41 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> región variable de cadena ligera (VL) de mAb humanizado 1G12-10.5 <400> 41 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL1 de cadena ligera de mAb humanizado 1G12-10.5 <400> 42 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL2 de cadena ligera de mAb humanizado 1G12-10.5 <400> 43 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL3 de cadena ligera de mAb humanizado 1G12-10.5 <400> 44 <210> 45 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> región variable de cadena pesada (VH) de mAb humanizado 1G12-10.6 <400> 45 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH1 de cadena pesada de mAb humanizado 1G12-10.6 <400> 46 <210> 47<211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH2 de cadena pesada de mAb humanizado 1G12-10.6 <400> 47 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH3 de cadena pesada de mAb humanizado 1G12-10.6 <400> 48 <210> 49 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> región variable de cadena ligera (VL) de mAb humanizado 1G12-10.6 <400> 49 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL1 de cadena ligera de mAb humanizado 1G12-10.6 <400> 50 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL2 de cadena ligera de mAb humanizado 1G12-10.6 7 <400> 51 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL3 de cadena ligera de mAb humanizado 1G12-10.6 <400> 52 <210> 53 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> región variable de cadena pesada (VH) de mAb humanizado 1G12-11.6 <400> 53 <210> 54 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH1 de cadena pesada de mAb humanizado 1G12-11.6 <400> 54 <210> 55 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH2 de cadena pesada de mAb humanizado 1G12-11.6 <400> 55 <210> 56 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH3 de cadena pesada de mAb humanizado 1G12-11.6 <400> 56 <210> 57 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> región variable de cadena ligera (VL) de mAb humanizado 1G12-11.6 <400> 57 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL11 de cadena ligera de mAb humanizado 1G12-11.6 <400> 58 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL2 de cadena ligera de mAb humanizado 1G12-11.6 <400> 59 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL3 de cadena ligera de mAb humanizado 1G12-11.6 <400> 60 <210> 61 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> región variable de cadena pesada (VH) de mAb humanizado 1G12-12.6 <400> 61 <210> 62 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH1 de cadena pesada de mAb humanizado 1G12-12.6 <400> 62 <210> 63 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH2 de cadena pesada de mAb humanizado 1G12-12.6 <400> 63 <210> 64 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH3 de cadena pesada de mAb humanizado 1G12-12.6 <400> 64 <210> 65 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> región variable de cadena ligera (VL) de mAb humanizado 1G12-12.6 <400> 65 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL1 de cadena ligera de mAb humanizado 1G12-12.6 <400> 66 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL2 de cadena ligera de mAb humanizado 1G12-12.6 <400> 67 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL3 de cadena ligera de mAb humanizado 1G12-12.6 <400> 68 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> secuencia de consenso de CDRL1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X es R o Q <400> 69 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> secuencia de consenso de CDRH1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (1) <223> X es D o G <400> 70 <210> 71 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> secuencia de consenso de CDRH2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12) .. (16) <223> X1 es N o A, X2 es F o A, y X3 es K o Q <400> 71 <210> 72 <211> 541 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72

ES 2 553 262 T3  

REIVINDICACIONES

1.

Anticuerpo aislado ligante de IL-18R1 humana y caracterizado por que comprende como las CDR de región variable de cadena pesada una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 2 ó SEC ID nº 10, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 3 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 4, y como CDR de región variable de cadena ligera, una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 6, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 7 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 8.

2.

Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende como región variable de cadena pesada, la secuencia SEC ID nº 1, y como región variable de cadena ligera, la secuencia SEC ID nº 5, o como región variable de cadena pesada, la secuencia SEC ID nº 9, y como región variable de cadena ligera, la secuencia SEC ID nº 11, 11.

3.

Anticuerpo aislado ligante de IL-18R1 humano y caracterizado por que comprende como: a) como CDR de región variable de cadena pesada, una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 30, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 31 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 32 y como región variable de cadena ligera una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 34, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 35 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 36 b) como CDR de región variable de cadena pesada, una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 38, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 39 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 40 y como región variable de cadena ligera una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 42, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 43 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 44 c) como CDR de región variable de cadena pesada, una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 46, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 47 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 48 y como región variable de cadena ligera una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 50, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 51 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 52 d) como CDR de región variable de cadena pesada, una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 54, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 55 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 56 y como región variable de cadena ligera una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 58, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 59 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 60, o e) como CDR de región variable de cadena pesada, una región CDRH1 de secuencia SEC ID nº 62, una región CDRH2 de secuencia SEC ID nº 63 y una región CDRH3 de secuencia SEC ID nº 64 y como región variable de cadena ligera una región CDRL1 de secuencia SEC ID nº 66, una región CDRL2 de secuencia SEC ID nº 67 y una región CDRL3 de secuencia SEC ID nº 68.

4.

Anticuerpo según la reivindicación 3, caracterizado por que comprende: a) como región variable de cadena pesada, SEC ID nº 29, y como región variable de cadena ligera, SEC ID nº 33, b) como región variable de cadena pesada, SEC ID nº 37, y como región variable de cadena ligera, SEC ID nº 41, c) como región variable de cadena pesada, SEC ID nº 45, y como región variable de cadena ligera, SEC ID nº 49, d) como región variable de cadena pesada, SEC ID nº 53, y como región variable de cadena ligera, SEC ID nº 57, o e) como región variable de cadena pesada, SEC ID nº 61, y como región variable de cadena ligera, SEC ID nº 65.

5.

Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que es del isotipo IgG1 humano, que comprende las mutaciones L234A, que es alanina en lugar de leucina en la posición aminoácida 234, y L235A, que es alanina en lugar de leucina en la posición aminoácida 235, en donde las numeraciones son según el índice EU.

6.

Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que es del isotipo IgG4 humano con o sin la mutación S228P, en donde las numeraciones son según el índice EU.

7.

Anticuerpo según la reivindicación 6, caracterizado por que comprende las mutaciones S228P y L235E, en donde las numeraciones son según el índice EU.

8.

Ácido nucleico codificante del anticuerpo según cualquiera de las realizaciones 1 a 7.

9.

Célula huésped que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 8.

ES 2 553 262 T3   10.

Método para la producción de un anticuerpo recombinante ligante de IL-18R1, caracterizado por que expresa un ácido nucleico según la reivindicación 8 en una célula huésped procariótica o eucariótica y recuperar dicho anticuerpo a partir de dicha célula o del sobrenadante del cultivo celular.

11.

Formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un portador farmacéuticamente aceptable.

12.

Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la utilización como medicamento.

13.

Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la utilización en el tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunológicas, artritis reumatoide, lupus, soriasis o enfermedades óseas.

14.

Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que se encuentra parcialmente fucosilado o no fucosilado.

15.

Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la utilización en el bloqueo de la interacción entre IL-18 e IL-18R1 y el bloqueo de la formación de complejo entre IL-18R1 e IL18RAP y la inhibición de la señalización mediada por el complejo de receptor de IL-18 y la activación de la ruta de NFkappaB.

ES 2 553 262 T3