Anticuerpo que tiene una especificidad tipo receptor de células T, con una afinidad aún mayor y el uso del mismo en la detección y el tratamiento del cáncer.

Un anticuerpo aislado que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nM a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno de tirosinasa restringido por HLA,

en donde dicho anticuerpo no se une a dicho MHC clase I humano en ausencia de dicho antígeno de tirosinasa restringido por HLA, en donde dicho anticuerpo no se une a dicho antígeno de tirosinasa restringido por HLA en ausencia de dicho MHC clase I humano y en donde dicho anticuerpo se une a células tumorales que presentan dicho MHC clase I humano que está formando un complejo con dicho antígeno de tirosinasa restringido por HLA.

Anticuerpo que tiene una especificidad tipo receptor de células T, con una afinidad aún mayor y el uso del mismo en la detección y el tratamiento del cáncer.

Campo y antecedentes de la invención La presente invención se refiere a las realizaciones como se caracterizan en las reivindicaciones.

Se demostró que la expresión de péptidos específicos en complejo con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I en células estaba asociada con cáncer y enfermedades autoinmunes (1-3) e infecciones víricas. En el cáncer, el descubrimiento de estos péptidos surgía de la observación ahora bien establecida de que las células tumorales humanas expresan con frecuencia antígenos que son reconocidos por linfocitos T citotóxicos (CTL) obtenidos de pacientes (1-5) .

Además, se ha demostrado que la respuesta inmune contra el tumor es insuficiente para causar la regresión tumoral y que las células tumorales pueden desarrollar mecanismos eficaces para escapar a dicho ataque inmune (6-9) . Por lo tanto, se están desarrollando numerosas estrategias en el campo de la vacunación contra tumores en un intento por aumentar las respuestas inmunes antitumorales, incluyendo vacunas de péptidos contra el cáncer, vacunas autólogas contra el cáncer y la vacuna híbrida de células cancerosas-dendríticas (7, 10, 11) .

Debido a que la especificidad de la respuesta inmune está regulada e impuesta por estos complejos de MHC clase I-péptido debería ser posible usar estos marcadores moleculares de superficie celular específicos y únicos como dianas para eliminar las células cancerosas, al tiempo que se evitan las células normales. Pueden emprenderse una estrategia similar para erradicar células infectadas por virus y células que presenten dianas para ataque autoinmune. Por lo tanto, sería muy deseable encontrar nuevas moléculas en una forma soluble que mimeticen la especificidad única refinada del receptor de antígeno de célula T (TCR) para los complejos de MHC-péptido asociados con cáncer/infecciones víricas/enfermedades autoinmunes.

Una estrategia prometedora es generar anticuerpos recombinantes que se unirán al complejo de MHC-péptido expresado en las superficies de células cancerosas con la misma especificidad que el TCR. Estos anticuerpos únicos pueden equiparse posteriormente con un resto citotóxico efector tal como un radioisótopo, un fármaco citotóxico o una toxina. Por ejemplo, se fusionaron genéticamente anticuerpos que se dirigen a células cancerosas con toxinas potentes obtenidas tanto de plantas como de bacterias, generando de este modo moléculas denominadas inmunotoxinas recombinantes (12) .

Los anticuerpos con la especificidad de células T restringida por MHC son poco frecuentes y han sido difíciles de generar mediante técnicas de hibridoma convencionales debido a que las células B no aprenden a autorrestringirse por MHC (13-16) . Las ventajas de la tecnología de anticuerpos presentados en fagos también hace posible seleccionar grandes repertorios de anticuerpos para anticuerpos únicos y poco frecuentes contra epítopos muy definidos. Esto se ha demostrado por la capacidad para aislar mediante presentación en fagos un anticuerpo restringido similar a TCR contra un H-2Kk de MHC clase I murino formando un complejo con un epítopo viral (17) . Evidentemente, este anticuerpo, que está dirigido al MHC de ratón, es inútil en el tratamiento y diagnóstico de seres humanos. Hasta ahora, han fracasado los intentos realizados por el mismo grupo para desarrollar un anticuerpo restringido similar a TCR contra un MHC clase I humano. Más recientemente se aisló un anticuerpo reactivo con el antígeno de melanoma MAGE-A1 en un complejo con HLA-A1; sin embargo, este anticuerpo presentaba una baja afinidad y podía usarse para detectar los complejos específicos en la superficie de células presentadoras de antígeno sólo cuando se expresan de una forma multimérica en un fago y no como un anticuerpo soluble (18) .

El documento WO-A-9702342 describe un procedimiento para producir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que reconozca específicamente un complejo de péptido-MHC. También se refiere a anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la invención que están conjugados con un agente farmacéutico o con un superantígeno. Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la invención para la prevención o tratamiento de enfermedades infecciosas y autoinmunes y del cáncer, y a composiciones para el diagnóstico de dichas enfermedades.

El documento WO-A-91/12332 se refiere a anticuerpos monoclonales restringidos caracterizados por su capacidad para reconocer específicamente un complejo que consiste en un péptido, que es característico de un antígeno de agente patógeno o un trastorno celular, y una molécula del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) que tiene la capacidad de reconocer y fijar este péptido, siendo dichos anticuerpos anticuerpos monoclonales restringidos en el sentido de que son incapaces de reconocer dicho péptido combinado con una molécula de MHC de haplotipo inespecífico de péptido. Estos anticuerpos pueden usarse para diagnosticar afecciones causadas por agentes infecciosos o trastornos celulares que se encontrarán, por ejemplo, en tumores o enfermedades autoinmunes.

Chames y col describe la selección directa de un fragmento de anticuerpo humano dirigido contra el epítopo de célula T tumoral HLA-A1-MAGE-A1 a partir de una biblioteca no inmunizada de fagos-Fab, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA vol. 97, no. 14, 05 Julio 2000, páginas 7969-7974.

Por lo tanto existe la necesidad ampliamente reconocida, y sería altamente ventajoso, de tener un anticuerpo restringido similar a TCR contra un MHC clase I humano desprovisto de las limitaciones anteriores.

Sumario de la invención En los últimos años, se han aislado muchos péptidos restringidos por MHC asociados con cáncer, asociados con infecciones víricas y enfermedades autoinmunes, y debido a su especificidad refinada altamente restringida, son dianas deseables para nuevas estrategias en inmunoterapia e inmunodiagnóstico. Los anticuerpos que son capaces de reconocer complejos de MHC-péptido asociados con cáncer, asociados con infecciones víricas y enfermedades autoinmunes, con la misma especificidad que el receptor de antígeno de célula T serían reactivos valiosos para estudiar la presentación de antígenos por células tumorales, células infectadas por virus y células relacionadas con enfermedades autoinmunes, para visualizar complejos de MHC-péptido en dichas células y, en última instancia, para desarrollar nuevos agentes de direccionamiento para inmunoterapia e inmunodiagnóstico del cáncer, infecciones víricas y enfermedades autoinmunes.

Cuando se reduce la presente invención a la práctica, y para generar moléculas ejemplares con una especificidad refinada única de este tipo, se inmunizaron ratones transgénicos HLA-A2 con un HLA-A2 de cadena sencilla soluble, formando un complejo con un epítopo restringido por HLA-A2 de célula T antigénico común obtenido del antígeno de diferenciación de melanoma gp100. Usando presentación en fagos, se aisló un anticuerpo scFv recombinante de alta afinidad que presenta una especificidad de unión similar a TCR característica con el epítopo derivado de gp100, aunque a diferencia de los TCR, lo hace con una afinidad en el intervalo nanomolar. El anticuerpo similar a TCR reconoce el complejo de MHC-péptido nativo expresado en la superficie de células presentadoras de antígeno. Además, cuando se fusionaba con una molécula efectora citotóxica muy potente en forma de una toxina bacteriana truncada, era capaz de destruir específicamente células presentadoras de antígeno de una forma dependiente de péptido y con una especificidad similar a TCR. Estos resultados demuestran por primera vez la capacidad para aislar anticuerpos recombinantes humanos de alta afinidad con la especificidad restringida por MHC específica de antígeno de células T dirigida hacia epítopos de células T cancerosas humanas. Los anticuerpos similares a TCR seleccionados son útiles para controlar y visualizar la expresión de complejos de MHC-péptido específicos en la superficie de células tumorales, otras células que presentan antígenos y tejidos linfoides, así como para desarrollar una nueva familia de agentes de direccionamiento para inmunoterapia.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona una molécula aislada que comprende un anticuerpo que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar, a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nM a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno de tirosinasa restringido por HLA, en donde dicho anticuerpo no se une a dicho MHC clase I humano en ausencia de dicho antígeno de tirosinasa restringido por HLA, en donde dicho anticuerpo no se une a dicho antígeno de tirosinasa restringido por HLA en ausencia de dicho MHC clase I humano y en donde dicho anticuerpo se une a células tumorales que presentan dicho MHC clase I humano que está formando un complejo con dicho antígeno de tirosinasa restringido por HLA.

2. Una molécula aislada que comprende el anticuerpo aislado de la reivindicación 1 conjugado con un resto identificable.

3. Una molécula aislada que comprende al anticuerpo aislado de la reivindicación 1 conjugado con un resto terapéutico.

4. Un procedimiento de producción de un anticuerpo que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nM a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno de tirosinasa restringido por HLA, comprendiendo el procedimiento:

inmunizar un mamífero no humano modificado genéticamente que tiene células que expresan dicho complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano con un complejo de MHC clase I de cadena sencilla y dicho antígeno de tirosinasa restringido por HLA, incluyendo dicho MHC clase I de cadena sencilla una secuencia de aminoácidos de -2 microglobulina humana funcional unida covalentemente directa o indirectamente a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de MHC clase I humano funcional que se produce por vía bacteriana en cuerpos de inclusión de E. coli;

aislar moléculas de ARNm a partir de células productoras de anticuerpos de dicho mamífero no humano;

producir una biblioteca de presentación de fagos que presenten moléculas proteicas codificadas por dichas moléculas de ARNm; y

aislar al menos un fago de dicha biblioteca de presentación de fagos por selección contra dicho complejo de dicho MHC clase I de cadena sencilla y dicho antígeno restringido por HLA,

presentando dicho al menos un fago dicho anticuerpo que puede unirse específicamente con dicho complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con dicho antígeno de tirosinasa restringido por HLA.

5. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la molécula aislada de la reivindicación 2 o 3, o el procedimiento de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo comprende un fragmento de anticuerpo y en donde dichos fragmentos de anticuerpo se unen específicamente a dicho MHC clase I que está formando un complejo con dicho antígeno de tirosinasa restringido por HLA.

6. El anticuerpo aislado, la molécula aislada o el procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab’, Fv y Fv de cadena sencilla (scFv) .

7. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la molécula aislada de la reivindicación 2 o 3, o el procedimiento de la reivindicación 4, en donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-A2.

8. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la molécula aislada de la reivindicación 2 o 3, o el procedimiento de la reivindicación 4, en donde dicha molécula de MHC clase I se selecciona del grupo que consiste en HLA-A1 y HLA-A24.

9. La molécula aislada de la reivindicación 2, en la que dicho resto identificable se selecciona del grupo que consiste en un miembro de un par de unión y un marcador.

10. La molécula aislada de la reivindicación 9, en la que dicho miembro de dicho par de unión es un antígeno.

11. La molécula aislada de la reivindicación 9, en la que dicho marcador se selecciona del grupo que consiste en una proteína fluorescente y una enzima.

12. La molécula aislada de la reivindicación 3, en la que dicho resto terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un resto citotóxico, un resto tóxico, un resto de citocina y un resto de anticuerpo biespecífico.