Anticuerpo monoclonal específico para péptido BETA A4.

Un anticuerpo monoclonal que enlaza específicamente con el péptido ßA4 que contiene un aminoácido terminal carboxi libre que se corresponde con el aminoácido 42 de la secuencia de aminoácidos del péptido ßA4 y no con la de los péptidos ßA4(1-40) y ßA4(1-43).

Anticuerpo monoclonal específico para el peptido βA4

Campo de la invención Esta solicitud se refiere a la enfermedad de Alzheimer, en particular, a un anticuerpo monoclonal específico para el péptido βA4 derivado de la proteína precursora de amiloide, células que producen dicho anticuerpo, métodos de generación dichos anticuerpos monoclonales, y a métodos para usar dichos anticuerpos en diagnóstico y terapia.

Antecedentes La enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno cerebral neurodegenerativo progresivo irreversible. Con el transcurso de los años, la progresión de la AD provoca pérdida de memoria, demencia y finalmente la muerte. Actualmente es la cuarta causa principal de muerte en los Estados Unidos y supone aproximadamente 100.000 muertes anuales. Habitualmente, la AD afecta principalmente a los ancianos y por lo tanto, con el envejecimiento de la sociedad moderna, se espera que sea un problema sanitario creciente en el futuro próximo. Poco después del inicio de la enfermedad, los pacientes requieren asistencia todo el día, Esto representa un tremendo problema psicobiológico así como financiero para nuestra sociedad. Actualmente no existen medios de diagnóstico, prevención, tratamiento o cura de la AD.

Neuropatológicamente, la AD se caracteriza por una masiva perdida neuronal en ciertas zonas del cerebro y por la deposición de material proteínico en el cerebro de los pacientes de AD. Estos depósitos son los neurofibrilares intracelulares y las placas de B-amiloide extracelulares. El principal componente proteínico de la placa de B-amiloide es el péptido βA4. El análisis de la secuencia del material de las placas de β-amiloide purificado y la espectrometría de masas mostró que la longitud máxima del péptido βA4 es de 43 aminoácidos, Habitualmente, sin embargo, pueden también terminar o bien en la posición 40 o en la posición 42 (Miller y cols., 1993, Arch. Biochem. Biophys. 301:41-52) . De forma similar, en el extremo N pueden observarse ciertas irregularidades, que dan como resultado varias formas diferentes del péptido, que se inician principalmente en la posición 1, 4 u 11 (Miller y cols., 1993) .

El clonado molecular reveló que el péptido βA4 se deriva de una proteína precursora mucho mayor denominada "proteína precursora de amiloide" (APP) (Kang y cols., 1987, Nature 325: 733-736) (Figura 1) . La Figura 1 ilustra la proteína precursora de amiloide (APP) que es una proteína transmembrana (Tm = región de la membrana) en la que el extremo N está localizado en la zona extracelular y el extremo C está localizado en la zona intracelular (citoplasmatica) , βA4 está parcialmente incrustado en la membrana. Se han descrito diversas isoformas con ayustes alternativos, que sufren grandes modificaciones postranslacionales (Selkoe, 1994, Arm. Rev. Neurosci.

17: 489-517) . La secuencia de βA4 en β está localizada parcialmente en la zona extracelular y se extiende parcialmente a la región transmembrana (Figura 2) . La Figura 2 (SEC ID NO: 3) ilustra la secuencia de βA4, que se muestra (zona demarcada con un circulo) con su extremo C en la región transmembrana (Tm, área recuadrada) y el extremo N localizado en la parte extracelular. Los asteriscos indican la localización de las mutaciones de las familias del gen APP: o bien flanquean la secuencia de βA4 o están centradas en la sección media de la secuencia de βA4. Se indican los tres sitios principales de escisión (α, β y γ) . Por lo0 tanto se postuló que la liberación de β4 se producía a través de la acción proteolítica de una o más proteasas en el extremo N (corte en β) y en el extremo C (corte en y) del péptido (Figura 2) (Selkoe, 1994) . El principal evento durante la secreción de APP está en el corte en α (posición 16/17 de βA4 "1-42") . Esta molécula de APP secretada (aAPPs) contiene los primeros 16 aminoácidos de la secuencia de βA4 en su extremo carboxilo. El resto de los fragmentos de APP asociados a la célula (los denominados fragmentos del extremo C (CTF) ) contienen la porción del extremo C de la secuencia de βA4 y abarcan la región citoplasmática de APP. Por lo tanto, este corte proteolítico produce fragmentos que pueden no procesarse de tal forma que directa o indirectamente produzcan fragmentos amiloidógenos (procesamiento no amiloidógeno) (Selkoe, 1994) .

Recientemente, se demostró que las líneas celulares que expresan grandes cantidades de APP a través de una construcción de ADNc de APP transfectada de forma estable producen cantidades de picomolares altas a nanomolares bajas de βA4 y lo liberan rápidamente al medio (Shoji y cols., 1992, Science 258: 126-129) . También se ha encontrado que casi todos los cultivos celulares primarios y las estirpes celulares liberan βA4 de forma constitutiva (Busciglio y cols., 1993, PNAS USA 90: 2092-2096) . Además, se ha demostrado que controles sanos así como pacientes de Alzheimer presentan cantidades nanomolares bajas de βA4 en suero y LCR (Seubert y cols., 1992, Nature 359: 325327) . La mayoría de las especies de βA4 solubles detectadas en estos fluidos corporales y medios acondicionados era βA4 "1-40", lo que no refleja verdaderamente la composición global que se encuentra en las deposiciones de las placas de β-amiloide. Por lo tanto ya no podría mantenerse la noción de que la producción y la posterior liberación de βA4 son suficiente y por lo tanto responsable de la acumulación de placas de β-amiloide en el cerebro de los pacientes de AD; otros factores deben contribuir a la deposición de las placas β-amiloide. Una hipótesis muy sencilla es que la producción excesiva aguda o crónica de βA4 provoca la mayor carga de amiloide que se observa en la AD.

El hallazgo de que mutaciones puntuales específicas en y alrededor de la región βA4 del gen APP están relacionadas con ciertos casos de enfermedad de Alzheimer familiar (FAD) demostraron inequívocamente que el gen APP es un "gen de enfermedad" (Goate y cols., 1991, Nature 349: 704-706; Murrell y cols., 1991, Science 254: 9799; Levy y cols., 1990, Science 248: 1124-1126; Carter y cols., 1992, Nature Genetics 2: 255-256) . En las familias en las que la AD se hereda de forma dominante con una edad especifica de inicio, las mutaciones puntuales del gen APP son necesarias y suficientes para provocar AD. Aunque la gran mayoría de los casos de enfermedad de Alzheimer son esporádicos y probablemente multifactoriales, estas mutaciones familiares de APP pueden enseñarnos mucho sobre la amiloidogenesis, es decir, la generación del pequeño péptido βA4 a partir del precursor mayor y su posterior deposición en placas de β-amiloide.

La doble mutación en un codón de APP 670/671 (la "variante sueca", en el extrema N de βA4 en APP) provoca una liberación de 5 a 8 veces mayor de βA4 en cultivos celulares transfectados de forma estable con ese ADNc de APP mutado (Figura 2) (Citron y cols., 1992; Cai y cols., 1993) . Puede concebirse que esta doble mutación puntual provoque un mayor procesamiento de APP debido a una mayor proteólisis en el corte en β, que a su vez produce un mayor nivel de βA4 liberado. Una mayor cantidad de monómeros βA4, tal como demuestran los estudios de transfección con la "mutación sueca", puede explicar la cinética más rápida de la agregación de βA4 a las placas de β-amiloide en estas familias.

Otra mutación de una FAD reside en el extremo C de βA4 en la posición 717 ("variante londinense") y no afecta al nivel de βA4 liberado en el cultivo tisular (Figura 2) . Recientemente se ha demostrado que esta mutación en 717 cambia la proporción entre βA4 "1-40/1-42" (Suzuki Ycols., 1994, Science 264: 1336-1340) . Aunque no está claro por ahora como se produce la generación del extremo C de βA4, dado que esta parte está incrustada en la región transmembrana, es tentadora la hipótesis de que la "mutación londinense" afecta a la escisión proteolítica de APP para producir βA4. Posiblemente, esta mutación puntual interfiere con la fidelidad de la escisión de la proteasa especifica en el sitio y. La βA4 1-40 muestra, entre otras cosas, una tremenda diferencia de solubilidad en soluciones acuosas comparado con la βA4 1-42 (Burdick y cols., 1992, JBC 267: 546-554) . Este es casi insoluble en agua, mientras que 1-40 es soluble en agua hasta varios mg/ml in vitro. Pequeñas cantidades de la forma más larga 1-42 pueden potenciar la precipitación de 1-40 in vitro de forma notable. Una proporción ligeramente mayor de la especie de βA4 1-42 explicaría el temprano inicio de la deposición de βA4 en las placas de β-amiloide en pacientes... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal que enlaza específicamente con el péptido βA4 que contiene un aminoácido terminal

carboxi libre que se corresponde con el aminoácido 42 de la secuencia de aminoácidos del péptido βA4 y no con la 5 de los péptidos βA4 (1-40) y βA4 (1-43) .

2. Un anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 que reconoce el aminoácido C-terminal 42 del péptido βA4 (SEQ ID NO:3) .

3. Un anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 que es un anticuerpo de la clase IgG.

4. Un anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 que es un anticuerpo de la subclase IgG1 o IgG2b.

5. Un fragmento inmunológicamente activo del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 que tiene la misma 15 especificidad de enlace que el anticuerpo de la reivindicación 1.

6. Una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 5, o una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para el uso en el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer.