Anticuerpo modificado.

Un ácido nucleico en la forma de un plásmido de ADN desnudo para su uso como un agente terapéutico,

en el que el ácido nucleico codifica una unidad monomérica de una molécula basada en un anticuerpo recombinante dimérica que comprende dos de dichas unidades monoméricas conectadas a través de un motivo de dimerización que consiste en una región bisagra derivada de Ig y un dominio Cy3, comprendiendo dicho motivo de dimerización una región bisagra y un dominio Cy3 de cada unidad monomérica, en la que cada una de las regiones bisagra contribuye a la dimerización por medio de puentes disulfuro con la otra región bisagra y cada dominio Cy3 contribuye a la dimerización por medio de interacciones hidrófobas con el otro dominio Cγ3, y en la que cada una de dichas unidades monoméricas consiste en una unidad de direccionamiento con especificidad para una molécula de superficie en una célula presentadora de antígenos, conectada a través de dicha región bisagra y dicho dominio Cγ3 a una unidad antigénica del COOH- terminal, y en la que cada una de dichas unidades monoméricas carece de un dominio CH2.

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo modificado

Referencias

La presente solicitud reivindica el 25 de febrero de 2003. prioridad respecto de la solicitud provisional de los EE.UU. Nº 60/450134, presentada

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso terapéutico de ácidos nucleicos que codifican moléculas humanas recombinantes basadas en anticuerpos denominadas Vaccicuerpos, que son capaces de desencadenar tanto una respuesta inmune de linfocitos T como de linfocitos B. Más particularmente, los Vaccicuerpos codificados inducen por sí mismos dichas respuestas inmunes fuertes por lo que los adyuvantes no se requieren necesariamente. La presente invención también hace posible un procedimiento para el tratamiento, por ejemplo, del mieloma múltiple por medio de dichas vacunas de ácidos nucleicos que codifican dichos Vaccicuerpos.

Antecedentes de la invención El mieloma múltiple (MM) es un cáncer de médula ósea en el que un solo clon de célula plasmática se vuelve maligno y produce inmunoglobulina (Ig) monoclonal. Los pacientes de MM tienen muy mal pronóstico. A pesar de que pueden alcanzarse tasas de respuesta altas y una supervivencia aumentada usando una alta dosis de quimioterapia seguida del trasplante autólogo o alogénico de células madre, la mayor parte de los pacientes recaen y pocos, o ninguno, se curan.

Las células de mieloma producen Ig monoclonales que son únicas para cada tumor y, por lo tanto, para cada paciente individual. La Ig está compuesta de dos cadenas pesadas (H) y dos ligeras (L) idénticas. Las cadenas L y H tienen regiones variables (V) altamente diversificadas, VL y VH. VL y VH forman conjuntamente el Fv (fragmento variable) que contiene determinantes antigénicos únicos denominados idiotopos (Id) . Los idiotopos constituyen colectivamente el idiotipo del Fv (de la Ig in casu) . La inducción de una respuesta inmune contra el idiotipo, denominada vacunación-Id es una estrategia prometedora en el tratamiento de los linfomas de linfocitos B y el MM (Bendandi, Gocke y col. 1999) (Tao y Levy 1993) (Huang, Wu y col. 2004) (Hakim, Levy y col. 1996) (King, Spellerberg y col. 1998) (Biragyn, Tani y col. 1999; Biragyn, Ruffini y col. 2002) , y tanto los anticuerpos anti-idiotípicos (Sirisinha y Eisen 1971; Hough, Eady y col. 1976) como los linfocitos T específicos de Id (Lauritzsen, Weiss y col. 1994) pueden ser importantes. Sin embargo, un Id es un auto-Ag débil en su contexto original (como parte de una Ig) . Por lo tanto, para fines de vacunación, es importante potenciar la inmunogenicidad del Id.

Los linfocitos T cooperadores (linfocitos T CD4+) reconocen a su antígeno (Ag) después de que este se haya procesado a través del atrapamiento de proteínas extrañas mediante las CPA, la rotura proteolítica en fragmentos peptídicos que se cargan en moléculas del MHC de clase II y se transportan a la superficie de las CPA donde se presenta el complejo péptido-MHC a los receptores de los linfocitos T (TCR) de los linfocitos T CD4 +. Los linfocitos T CD4+ activados estimulan a los linfocitos T citotóxicos (linfocitos T CD8+) y a los linfocitos B con la correspondiente especificidad de Ag, iniciando una amplia respuesta contra el Ag original. Un problema importante que concierne a la vacunación Id de los pacientes de MM es que los linfocitos T CD4+ específicos de Id en estos pacientes, como se extrapola de los experimentos en ratones [18], probablemente son tolerantes a los determinantes de la región V del Id en la proteína de mieloma altamente abundante. Los pacientes de MM que se han sometido a un trasplante autólogo de células madre (TACM) pueden estar en una fase ventajosa para la vacunación Id por los dos siguientes motivos: 1) el alivio de la tolerancia de los linfocitos T a los Id de la proteína de mieloma y 2) desarrollo de nuevos linfocitos T que pueden responder a la vacunación Id.

El direccionamiento de los epítopos de los linfocitos T a las moléculas de superficie en las CPA con Troyacuerpos (Lunde, Munthe y col. 1999) , que están equipados con un epítopo de linfocito T incorporado en un bucle de un dominio constante de la Ig, da como resultado la estimulación aumentada de los linfocitos T mediante un factor de 100-100000 (Lunde, Rasmussen y col. 2001) . Sin embargo, los Troyacuerpos no incluyen el Ag en su conformación nativa, tal como Fv, y, por lo tanto, se restringen a la inducción de respuestas de linfocitos T. Por lo tanto, para inducir una respuesta anti-Id de linfocitos B y Ac anti-Id, es necesario incluir el Fv completo del componente M del paciente. Con respecto a la inducción de una respuesta anti-Id de linfocitos T, una inclusión del Fv completo aumentará en gran medida la posibilidad de incluir secuencias idiotípicas que se unan a las moléculas de HLA del paciente, lo cual es un prerrequisito para la activación de linfocitos T específicos de Id.

Ha habido varios enfoques para rendir idiotipos más inmunogénicos. La vacunación con proteínas con inmunoglobulinas (Ig) Id+ completas fusionadas con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) (Tao y Levy 1993) , o ligando CD40 (Huang, Wu y col. 2004) potencia el nivel de anticuerpos anti-Id y da como resultado la protección contra el linfoma de linfocitos B en ratones. Sin embargo, scFv-GM-CSF solamente fue eficaz cuando se inyectó como proteína y no como vacuna de ADN (Hakim, Levy y col. 1996) . Por otra parte, la vacunación con ADN empleando scFv fusionado con IL-1β indujo inmunidad tumoral (Hakim, Levy y col. 1996) . En otro enfoque, se fusionó genéticamente scFv con el fragmento C de la toxina tetánica y se suministró como una vacuna de

ADN mediante inyección intramuscular (i.m.) . Esta estrategia ha dado como resultado niveles aumentados de anticuerpos anti-Id, las respuestas CD4+ específicas de Id y la protección contra linfoma y mielomas en ratones. Se desconoce el mecanismo de la actividad adyuvante del fragmento C del toxoide tetánico (King, Spellerberg y col. 1998) . En un enfoque similar, se ha fusionado el scFV con quimiocinas como MCP3, IP10 mDF2β (Biragyn, Tani y col. 1999; Biragyn, Ruffini y col. 2002) y se ha usado tanto como vacuna de ADN como de proteínas (Biragyn, Tani y col. 1999) . En varios de estos estudios, los epítopos extraños de linfocitos T que corresponden al fragmento C del TT o secuencias de fusión únicas podrían haber contribuido a las respuestas. Se han observado unas respuestas anti-Id y una protección del tumor mayores. Se desconoce el mecanismo de acción del scFv-quimiocina. Una posibilidad es que el resto de la quimiocina dirija el Fv a los receptores de quimiocina en las CPA para el suministro potenciado de scFV. Como alternativa, las quimiocinas atraen CPA al sitio de inyección. Sin embargo, tanto las estrategias de fusión del Fragmento C como las de quimiocina se basan en la unión monovalente a sus moléculas diana (King, Spellerberg y col. 1998; Biragyn, Tani y col. 1999) . Esto es de interés debido a que se ha mostrado que la reticulación es importante para la estimulación óptima de los linfocitos T, por ejemplo, para los Troyacuerpos (Lunde, Munthe y col. 1999) .

Con estas consideraciones en mente, los inventores han diseñado un nuevo tipo de moléculas similares a anticuerpos recombinantes denominadas Vaccicuerpos, una molécula divalente que comprende una bisagra flexible, sin unión al FcR y que contiene el Ag en su conformación nativa, con el fin de inducir tanto respuestas fuertes de Ac de Id como de linfocitos T específicos. Los Vaccicuerpos son macromoléculas grandes y complejas, pero, sorprendentemente, las células fueron capaces de producir y exportar moléculas intactas.

"Vaccibodies: future vaccines for B cell lymphoma and myeloma?" por Brunsvik A y col. es un póster publicado el 5 de Febrero en 2003 en Banff. El póster desvela un estudio inmunológico de la inmunogenicidad de las moléculas derivadas de anticuerpos denominadas "vaccicuerpos" que portan scFV (Id) de la proteína de mieloma M315.

Sumario de la invención La presente invención se basa en la construcción de un nuevo tipo de moléculas similares a anticuerpos recombinantes humanos útiles en el tratamiento de, por ejemplo, mieloma múltiple. Estas moléculas, denominadas Vaccicuerpos, se unen a CPA y son capaces de desencadenar tanto una respuesta inmune de linfocitos T como de linfocitos B. Además, los Vaccicuerpos se unen divalentemente a las CPA para promover una iniciación más eficaz de una respuesta inmune. De este modo, un fin principal de la presente invención es inducir una respuesta inmune fuerte para hacer a los adyuvantes redundantes. Los Vaccicuerpos comprenden un dímero de una unidad monomérica que consiste en una unidad de direccionamiento con especificidad para una molécula... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico en la forma de un plásmido de ADN desnudo para su uso como un agente terapéutico, en el que el ácido nucleico codifica una unidad monomérica de una molécula basada en un anticuerpo recombinante dimérica que comprende dos de dichas unidades monoméricas conectadas a través de un motivo de dimerización que consiste en una región bisagra derivada de Ig y un dominio Cy3, comprendiendo dicho motivo de dimerización una región bisagra y un dominio Cy3 de cada unidad monomérica, en la que cada una de las regiones bisagra contribuye a la dimerización por medio de puentes disulfuro con la otra región bisagra y cada dominio Cy3 contribuye a la dimerización por medio de interacciones hidrófobas con el otro dominio Cγ3, y en la que cada una de dichas unidades monoméricas consiste en una unidad de direccionamiento con especificidad para una molécula de superficie en una célula presentadora de antígenos, conectada a través de dicha región bisagra y dicho dominio Cγ3 a una unidad antigénica del COOH-terminal, y en la que cada una de dichas unidades monoméricas carece de un dominio CH2.

2. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 1, en el que dicha unidad de direccionamiento es un fragmento variable monocatenario de Ig (scFv) .

3. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 2, en el que dicho scFv es anti-HLA, anti-CD14 o anti-receptor de tipo toll.

4. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 3, en el que dicho anti-HLA es anti-HLA-DP.

5. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 3, en el que dicho anti-receptor de tipo toll es un anti-receptor de tipo toll 2.

6. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 1, en el que dicha unidad de direccionamiento es un ligando.

7. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 6, en el que dicho ligando es el ligando CD40 soluble o una quimiocina.

8. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 6, en el que dicho ligando es una quimiocina.

9. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 7 u 8, en el que dicha quimiocina es RANTES o MIP-1α.

10. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 7 u 8, en el que dicha quimiocina es MIP-1α.

11. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 1, en el que dicha unidad de direccionamiento es un antígeno bacteriano.

12. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 11, en el que el antígeno bacteriano es una flagelina.

13. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 1, en el que la unidad de direccionamiento tiene la capacidad de dirigirse a HLA-DP, CD14, CD40, receptores de tipo toll, o receptores de quimiocinas.

14. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 13, en el que la unidad de direccionamiento tiene la capacidad de dirigirse a HLA-DP.

15. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 1, en el que la unidad de direccionamiento tiene la capacidad de dirigirse a receptores de quimiocinas.

16. El ácido nucleico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la unidad antigénica es un scFv antigénico.

17. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 16, en el que el scFv antigénico se deriva de una Ig monoclonal producida por mieloma o linfoma.

18. El ácido nucleico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en el que la (s) unidad (es) antigénica (s) se deriva (n) de una proteína de cáncer, tal como una telomerasa, o una parte funcional de la misma.

19. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 18, en el que dicha proteína de cáncer es hTERT.

20. El ácido nucleico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en el que la (s) unidad (es) antigénica (s) se deriva (n) de una bacteria.

21. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 20, en el que la (s) unidad (es) antigénica (s) derivada (s) de la bacteria es/son un antígeno de tuberculosis.

22. El ácido nucleico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15 en el que la (s) unidad (es) antigénica (s) se deriva (n) de un virus.

23. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 22, en el que la (s) unidad (es) antigénica (s) derivada (s) del virus se deriva (n) del VIH.

24. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 23, en el que la (s) unidad (es) antigénica (s) derivada (s) del VIH se deriva (n) de gp120.

25. El ácido nucleico para el uso de la reivindicación 1, en el que la región bisagra comprende tanto el exón h1 como el h4 de hIgG3.

26. El ácido nucleico para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el uso es un procedimiento para tratar cáncer o una enfermedad infecciosa.

27. El ácido nucleico para el uso de acuerdo con la reivindicación 26, que es administrado por medio de una dispersión 10 coloidal o inyección intramuscular seguida de electroporación.

28. El ácido nucleico para el uso de acuerdo con la reivindicación 27, en el que la dispersión coloidal es un liposoma o lipoplexo.

29. El ácido nucleico para el uso de acuerdo con la reivindicación 27, en el que el medicamento es administrado por medio de una inyección intramuscular seguida de electroporación.

30. El ácido nucleico para el uso de acuerdo con la reivindicación 26, en el que el cáncer es mieloma múltiple o linfoma en un mamífero.

31. El ácido nucleico para el uso de acuerdo con la reivindicación 26, en el que la enfermedad infecciosa es una infección por VIH o tuberculosis.

32. Uso del ácido nucleico definido en una cualquiera de las reivindicaciones de 1-25 para la fabricación de un 20 medicamento para el tratamiento del cáncer o una enfermedad infecciosa.

33. Uso de la reivindicación 32, en el que el medicamento es administrado por medio de una dispersión coloidal o inyección intramuscular seguida de electroporación.

34. Uso de la reivindicación 33, en el que la dispersión coloidal es un liposoma o lipoplexo.

35. Uso de la reivindicación 33, en el que el medicamento es administrado por medio de una inyección intramuscular 25 seguida de electroporación.

36. Uso de la reivindicación 32, en el que el cáncer es mieloma múltiple o linfoma en un mamífero.

37. Uso de la reivindicación 32, en el que la enfermedad infecciosa es una infección por VIH o tuberculosis.