Composición de anticuerpo genéticamente recombinante que tiene una actividad efectora mejorada.

Anticuerpo, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 34 o 33

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2008/050993.

Solicitante: KYOWA HAKKO KIRIN CO., LTD..

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 1-6-1, OHTEMACHI CHIYODA-KU TOKYO 100-8185 JAPON.

Inventor/es: SHITARA, KENYA, NIWA,Rinpei , NATSUME,AKITO.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/10 (Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/09 (Tecnología del ADN recombinante)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/395 (Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/08 (Anticuerpos monoclonales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/46 (Inmoglobulinas híbridas (híbridos de una inmunoglobulina con un péptido distinto de una inmunoglobulina C07K 19/00))

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Fragmento de la descripción:

Composición de anticuerpo genéticamente recombinante que tiene una actividad efectora mejorada.

Campo técnico

La presente divulgación se refiere a una composición de anticuerpo recombinante que es un anticuerpo IgG1 humano, que comprende un dominio CH2 en el que los aminoácidos en las posiciones 276 y 339 indicadas por el índice EU como en Kabat, et al. son sustituidos por otros aminoácidos y que tiene una actividad citotóxica dependiente de complemento mejorada en comparación con un anticuerpo que comprende un dominio CH2 antes de que los aminoácidos sean sustituidos; un ADN que codifica la molécula de anticuerpo o una región constante de cadena pesada de la molécula de anticuerpo contenida en la composición de anticuerpo recombinante; un transformante obtenible mediante la introducción del ADN en una célula hospedadora; un procedimiento para producir la composición de anticuerpo recombinante utilizando el transformante; y un medicamento que comprende la composición de anticuerpo recombinante como ingrediente activo.

Antecedentes de la técnica Ya que los anticuerpos son moléculas de proteína que tienen una actividad de unión elevada y una especificidad de unión a una molécula diana (antígeno) y una elevada estabilidad en sangre, se han intentado aplicaciones de los mismos para el diagnóstico, en agentes preventivos y terapéuticos para varias enfermedades humanas (Documento no de patente 1) . A pesar de que los anticuerpos se producen generalmente mediante la administración (la inmunización) de un antígeno a un animal no humano, los anticuerpos obtenidos a partir de un animal no humano tienen una secuencia de aminoácidos específica de la especie y se provocan efectos secundarios debido a que los anticuerpos son reconocidos como sustancias ajenas en el cuerpo humano. Por consiguiente, se han preparado anticuerpos híbridos o anticuerpos humanizados a partir de anticuerpos derivados de animales otros que humanos (animales no humanos) utilizando técnicas de recombinación genética (Documentos no de patente 2 a 5) .

Los anticuerpos híbridos y los anticuerpos humanizados han resuelto problemas que presentaban los anticuerpos animales como los anticuerpos de ratón, tales como la alta inmunogenicidad, la baja función efectora o la corta vida media en sangre, y se hicieron posibles aplicaciones de anticuerpos monoclonales en preparaciones farmacéuticas utilizando dichos anticuerpos (Documentos no de patente 6 a 9) . En los Estados-Unidos, por ejemplo, ya se han aprobado una pluralidad de anticuerpos humanizados como un anticuerpo para el tratamiento del cáncer y están en el mercado (Documento no de patente 10)

Estos anticuerpos híbridos y anticuerpos humanizados muestran de hecho efectos hasta un cierto grado a nivel clínico, pero existe una demanda de anticuerpos terapéuticos que presenten mayores efectos. Por ejemplo, en el caso de la administración única de Rituxan (Documento no de patente 11) (producido por IDEC/Roche/Genentech) que es un anticuerpo híbrido para CD20, se ha informado que su ratio de respuesta para pacientes de linfoma no de Hodgkin de baja malignidad recurrente en el ensayo clínico de fase III no es mayor que 48% (remisión completa 6%, remisión parcial 42%) , y su duración media de respuesta es de 12 meses (Documento no de patente 12) . En el caso de la utilización combinada de Rituxan y quimioterapia (CHOP: Ciclofosfamida, Doxorubicin, Vincristine) , se ha informado de que el ratio de respuesta para pacientes recurrentes de linfoma no de Hodgkin folicular y de baja malignidad hasta el ensayo clínico de fase II es de 95% (remisión completa 55% remisión parcial 45%) , pero que se hallaron efectos secundarios debido a CHOP (Documento no de patente 13) . En el caso de una administración única de HErceptin (producido por Genentech) , que es un anticuerpo humanizado contra HER2, se ha informado de que su ratio de respuesta en pacientes de cáncer de pecho metastático en el ensayo clínico de fase III es sólo de 15% y su duración de respuesta medio es de 9, 1 meses (Documento no de patente 14) .

La molécula de anticuerpo humano también se denomina inmunoglobulina (de ahora en adelante denominada Ig) y está clasificada en isotipos de IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y IgM en base a su estructura molecular. Teniendo IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4 una homología relativamente elevada en las secuencias de aminoácidos, éstas se denominan genéticamente IgG. Las IgG humanas son utilizadas principalmente como anticuerpos terapéuticos.

Una molécula de anticuerpo comprende dos tipos de polipéptidos, es decir, una cadena pesada (de ahora en adelante denominada cadena H) y una cadena ligera (de ahora en adelante denominada cadena L) . Una molécula de anticuerpo IgG humano comprende dos cadenas H y dos cadenas L. Asimismo, una cadena H comprende una región variable de cadena H (de ahora en adelante denominada VH) y una región constante de cadena H (de ahora en adelante denominada CH) , y una cadena L comprende una región variable de cadena L (de ahora en adelante denominada VL) y una región constante de cadena L (de ahora en adelante denominada CL) . La región constante de cadena H comprende cuatro dominios que se denominan respectivamente dominio CH1, bisagra, CH2 y CH3, desde el dominio cercano a VH localizado en el extremo N-terminal de la cadena pesada en este orden. También, el dominio CH2 y el dominio CH3 en combinación se denominan Fc.

Un anticuerpo se une a un antígeno vía una región de unión a antígeno (de ahora en adelante denominada Fv) que comprende VH y VL y se une a una molécula efectora del sistema inmune tal como un receptor o un complemento

vía la región constante de cadena H. Por mediación de la unión a la molécula efectora en el sistema inmune, el anticuerpo induce una actividad efectora tal como una actividad citotóxica mediada por la célula dependiente de complemento (de ahora en adelante denominada actividad CDC) , una actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpo (de ahora en adelante denominada actividad ADCC) o una actividad fagocítica para eliminar el antígeno o las células (un patógeno o células tumorales) que expresan el antígeno.

Para inducir la actividad ADCC o la actividad fagocítica, es importante que el anticuerpo se una a un miembro de la familia de receptores gamma Fc (de ahora en adelante denominada FcγR) expresado en la superficie de varios leucocitos tales como los linfocitos citolíticos naturales (de ahora en adelante denominados células NK) , monocitos, macrófagos o granulocitos. La familia FcγR incluye FcγR activados y FcγR regulados. FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa y FcγRIIIb pertenecen a los FcγR activados, y FcγRIIb pertenece a los FcγR regulados. Un anticuerpo IgG humano se une fuertemente a tal receptor y consecuentemente induce la actividad ADCC o la actividad fagocítica de leucocitos.

La actividad ADCC es una reacción en la que leucocitos como las células NK lisan principalmente células diana por mediación de un anticuerpo. El anticuerpo se une a un antígeno en la superficie de las células diana vía Fv y se une a FcγRIIIa en la superficie de las células NK vía Fc. Como resultado, las células NK liberan moléculas citotóxicas tales como perforina o grancima y de este modo lisan las células diana (documentos no de patente 15 y 16) .

La actividad CDC es una reacción en la que un grupo de proteínas séricas denominadas complementos lisa células diana por mediación de un anticuerpo. Los complementos están clasificados en proteínas C1 a C9 y están sujetos a reacciones en cadena para de este modo inducir la actividad CDC: Cada una de las proteínas del complemento se activan reaccionando con una proteína... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Anticuerpo, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 34 o 33.

2. Composición de anticuerpo recombinante, que contiene el anticuerpo según la reivindicación 1.

3. Composición de anticuerpo recombinante según la reivindicación 2 o un anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende una molécula de anticuerpo IgG1 humano que tiene cadenas de azúcar de tipo complejo unidas por enlace N-glicosídico a la región Fc,

(A) en la que la proporción de cadenas de azúcar en las que la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina en el extremo terminal reductor de las cadenas de azúcar de entre el total de cadenas de azúcar de tipo complejo unidas por enlace N-glicosídico que se unen al Fc contenidas en la composición es 20% o más, o

(B) en la que las cadenas de azúcar de tipo complejo unidas por enlace N-glicosídico, unidas a la región Fc del anticuerpo, son cadenas de azúcar en las que la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina en el extremo terminal reductor en las cadenas de azúcar.

4. ADN, que codifica

(A) una molécula de anticuerpo contenida en la composición de anticuerpo recombinante según la reivindicación 2 o el anticuerpo según la reivindicación 1, o

(B) una región constante de la cadena pesada humana de una molécula de anticuerpo contenida en la composición de anticuerpo recombinante según la reivindicación 2 o el anticuerpo según la reivindicación 1.

5. Transformante obtenible mediante la introducción de ADN según la reivindicación 4 en una célula hospedadora aislada.

6. Transformante según la reivindicación 5, en el que la célula hospedadora es una célula resistente a una lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar, en la que la posición 1 de una fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el extremo terminal reductor a través de un enlace α en la cadena de azúcar unida por enlace N-glicosídico.

7. Transformante según la reivindicación 5, en el que cuando un gen que codifica una molécula de anticuerpo se introduce en la célula hospedadora, dicha célula hospedadora es capaz de producir una composición de anticuerpo que comprende una molécula de anticuerpo que tiene cadenas de azúcar de tipo complejo unidas por enlace Nglicosídico en la región Fc, y

(A) en el que la proporción de cadenas de azúcar, en las que una fucosa no está unida a N-acetilglucosamina en el extremo terminal reductor de las cadenas de azúcar de entre el total de cadenas de azúcar unidas por enlace N-glicosídico que se unen a la región Fc contenidas en la composición es 20% o más, o

(B) en el que las cadenas de azúcar de tipo complejo unidas por enlace N-glicosídico que están unidas a la región Fc del anticuerpo son cadenas de azúcar, en las que una fucosa no está unida a Nacetilglucosamina en el extremo terminal reductor en las cadenas de azúcar.

8. Transformante según la reivindicación 7, en el que las cadenas de azúcar, en las que una fucosa no está unida a las cadenas de azúcar son cadenas de azúcar, en las que la posición 1 de una fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el extremo terminal reductor a través de un enlace α en la cadena de azúcar de tipo complejo unida por enlace N-glicosídico.

9. Transformante según la reivindicación 5,

(A) en el que la célula hospedadora es una célula, en la que un genoma está modificado de tal forma que se tenga una actividad reducida o suprimida de una enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido de azúcar intranuclear, GDP-fucosa, o una enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar, en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el extremo terminal reductor a través de un enlace α en la cadena de azúcar de tipo complejo unida por enlace Nglicosídico,

o

(B) en el que la célula hospedadora es una célula, en la que todos los alelos en un genoma que codifican una enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido de azúcar intracelular, GDP-fucosa, o una enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa está unida a

la posición 6 de N-acetilglucosamina en el extremo terminal reductor a través de un enlace α en la cadena de azúcar de tipo complejo unida por enlace N-glicosídico están desactivados.

10. Transformante según la reivindicación 9,

en el que la enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido de azúcar intracelular, GDP-fucosa, es una enzima seleccionada de entre GDP-manosa 4, 6-deshidratasa (GMD) y GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa-3, 5epimerasa (Fx) ,

o en el que la enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar, en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el extremo terminal reductor a través de un enlace α en la cadena de azúcar de tipo complejo unida por enlace N-glicosídico es α-1, 6-fucosiltransferasa.

11. Transformante según la reivindicación 10,

(A) en el que la GDP-manosa 4, 6-deshidratasa es una proteína codificada por una ADN seleccionado de entre el grupo que consiste en los siguientes a) y b) o es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en los siguientes c) a e) :

a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID NO: 18;

b) un ADN que se hibrida con el ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID NO:18 bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que tiene una actividad GDP-manosa 4, 6deshidratasa;

c) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 19;

d) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que uno o más aminoácidos están suprimidos, sustituidos, insertados y/o añadidos en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID NO: 19 y que tiene una actividad GDP-manosa 4, 6-deshidratasa;

e) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más de homología con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID NO: 19 y que tiene una actividad GDP-manosa 4, 6-deshidratasa.

(B) en el que la GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa-3, 5-epimerasa es un proteína codificada por un ADN seleccionado de entre el grupo que consiste en los siguiente a) y b) o es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en los siguientes c) a e) :

a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representados por la SEC ID NO: 20;

b) un ADN que se hibrida con el ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID NO: 20 bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que tiene una actividad GDP-4-ceto-6desoxi-D-manosa-3, 5-epimerasa;

c) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID NO:21;

d) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos, en la que uno o más aminoácidos están suprimidos, sustituidos, insertados y/o añadidos en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID NO:21 y que tiene una actividad GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa-3, 5-epimerasa.

e) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más de homología con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID NO:21 y tiene una actividad GDP-4-ceto-6-desoxiD-manosa-3, 5-epirmerasa; o (C) en el que la α-1, 6-fucosiltransferasa es una proteína codificada por un ADN seleccionado de entre el grupo que consiste en los siguientes a) a d) o es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en los siguientes e) a j) :

a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID NO:22;

b) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID NO:23;

c) un ADN que se hibrida con el ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID NO:22 bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que tiene una actividad α-1, 6fucosiltransferasa;

d) un ADN que se hibrida con el ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID NO:23 bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que tiene una actividad α-1, 6fucosiltransferasa;

e) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID NO:24;

f) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID NO:25;

g) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos, en la que uno o más aminoácidos están suprimidos, sustituidos, insertados y/o añadidos en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID NO:24 y que tiene una actividad α-1, 6-fucosiltransferasa;

h) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que uno o más aminoácidos están suprimidos, sustituidos, insertados y/o añadidos en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID NO:25 y que tiene una actividad α-1, 6-fucosiltransferasa;

i) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más de homología con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID NO:24 y tiene una actividad α-1, 6fucosiltransferasa;

j) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más de homología con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID NO:25 y tiene una actividad α-1, 6fucosiltransferasa.

12. Transformante según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en el que la célula hospedadora es una célula seleccionada de entre el grupo que consiste en los siguientes (a) a (i) :

(a) una célula CHO derivada de tejido de ovario de hámster chino;

(b) una célula de línea celular de mieloma de rata, YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20;

(c) una célula de línea celular de mieloma de ratón, NS0;

(d) una célula de línea celular de mieloma de ratón, SP2/0-Ag14;

(e) una célula BHK derivada de tejido de riñón de hámster sirio;

(f) una célula de hibridoma productora de anticuerpos;

(g) una célula de línea celular de leucemia humana, Namalwa;

(h) una célula madre embrionaria no humana;

(i) un óvulo fecundado no humano.

13. Procedimiento para producir una composición de anticuerpo recombinante o un anticuerpo, que comprende cultivar el transformante según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12 en un medio para formar y acumular la composición de anticuerpo o anticuerpo en el cultivo; y recuperar y purificar la composición de anticuerpo o anticuerpo a partir del cultivo.

14. Composición farmacéutica que comprende la composición de anticuerpo recombinante o el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 como ingrediente activo.