ANTICUERPO FRENTE AL RECEPTOR OPIOIDE TIPO DELTA1b DE DANIO RERIO.

Anticuerpo frente al receptor opioide tipo Delta1b de danio rerio.

La presente invención proporciona anticuerpos

, preferiblemente policlonales, específicos frente al receptor opioide tipo Delta1b de pez cebra, los cuales son capaces de reconocer dicho receptor específicamente sin presentar reactividad cruzada con otros tipos receptores opioides. Además, la invención proporciona un antígeno del receptor opioide tipo Delta1b de pez cebra empleado para la generación de dichos anticuerpos, así como un método de obtención de dichos anticuerpos y un kit que comprende dichos anticuerpos para la detección del receptor opioide tipo Delta1b de pez cebra.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201330192.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE SALAMANCA.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: ARÉVALO MARTIN,Juan Carlos, RODRIGUEZ RODRIGUEZ,Raquel E.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/12 (Genes que codifican proteínas animales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/705 (Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/28 (contra receptores, antígenos celulares de superficie o determinantes celulares de superficie)

PDF original: ES-2486116_A1.pdf

 

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ANTICUERPO FRENTE AL RECEPTOR OPIOIDE TIPO DELTA1b DE DANIO RERIO.

Fragmento de la descripción:

La presente invención se encuadra en el campo de la inmunología, específicamente dentro de los anticuerpos específicos frente a los receptores opioides de tipo Deltalb (D1b) de pez cebra (Danio rerio) y de sus métodos de obtención.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Los receptores opioides pertenecen a la superfamilia de los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs), cuya importancia estriba en que intervienen en el mecanismo de acción de muchas hormonas y neurotransmisores conocidos. Los receptores opioides están constituidos por un dominio N-terminal extracelular, 7 dominios transmembrana conectados por 3 lazos intracelulares y 3 lazos extracelulares y una cola C-terminal intracelular. Según su estructura tridimensional, es conocido que los dominios transmembrana de los receptores opioides forman hélices muy unidas, orientadas en contra de las agujas del reloj. Junto a los lazos extracelulares, esta estructura da lugar a una interfase dinámica a la cual se unen los ligandos opioides.

Los receptores opioides comparten una homología en su secuencia aminoacídica de aproximadamente un 60%. Existen desde el punto de vista farmacológico tres receptores opioides: mu, delta y kappa. Los receptores p (MOR) presentan una alta afinidad por el agonista peptídico DAMGO, por la morfina y sus derivados, como la morfina-6-(B- glucurónido, y por los antagonistas CTOP y naloxonacina, así como por las endorfinas, consideradas sus agonistas endógenos. Por su parte, los receptores opioides 5 (DOR) tienen una alta afinidad por los agonistas DPDPE, DSLET, deltorfina II y por el antagonista naltrindol, compuestos que se unen con menor afinidad a los receptores k y p. Además, de acuerdo con estudios farmacológicos y de comportamiento, se ha propuesto la existencia de subtipos del receptor 5 (Sofuoglu et al., 1991, Pharmacol Exp Ther., 257(2):676-680): el receptor 51, que es activado selectivamente por DPDPE y bloqueado por el antagonista BNTX; y el receptor 52 que es activado selectivamente por la deltorfina II y bloqueado por el antagonista NTB. Además, ambos subtipos son activados por los péptidos endógenos encefalinas y por la p-endorfina y bloqueados con alta afinidad por el antagonista naltrindol. Se ha descrito que los receptores kappa, con muy poca afinidad por la morfina, están

relacionados con el sistema inmune. También se conoce un receptor tipo opioide (ORL), que no presenta actividad analgésica.

Las sustancias opioides son conocidas fundamentalmente por su actividad analgésica, así como por su capacidad de inducir tolerancia, dependencia y en algunas ocasiones, adicción, tras un consumo prolongado. Sin embargo, la existencia de varios subtipos farmacológicos de cada receptor opioide, y la ausencia de caracterización genética que pudiera determinar si cada subtipo farmacológico procedía de un gen diferente, obligaron a la comunidad científica a abrir nuevas puertas en la investigación sobre la actividad del sistema opioide. Una vez clonados los tres genes que codifican para los tres receptores opioides clásicos, mu, delta y kappa, se comenzó a elucidar la actividad farmacológica y funcional de cada uno de estos receptores, y además de su capacidad analgésica, su posible implicación en distintos procesos que forman parte del desarrollo embrionario, como la proliferación celular, la neurogénesis, la diferenciación neuronal o la protección neuronal frente a diversos daños producidos por ausencia de oxígeno o por la presencia de alguna sustancia tóxica. En concreto, los receptores opioides mu y kappa potencian la neurogénesis, el receptor opioide kappa incrementa la tasa de proliferación celular cuando es activado por la morfina y el receptor opioide delta interviene tanto en neurogénesis como en protección neuronal.

Trabajos previos han demostrado la estrecha relación que existe entre la caracterización molecular y farmacológica de los receptores opioides descritos hasta el momento (MOR, DOR, KOR y ORL) de pez cebra y de mamíferos avalando así la idoneidad del pez cebra como modelo experimental para el estudio de los mecanismos que describen el dolor y la drogodependencia. La evolución de los receptores opioides en las especies analizadas, incluida el pez cebra, ocurre de manera paralela, y así, el receptor mu de pez cebra es homólogo al receptor mu de humano, rata y ratón, y los receptores tipo delta de pez cebra son homólogos al receptor delta de mamífero.

En concreto, en los últimos años se han clonado cinco receptores de pez cebra semejantes a los receptores opioides de mamíferos, a los que se ha denominado: ZFOR1 (del inglés, Zebrafish Opioid Receptor 1), actualmente llamado ZfDORI, que presenta homología con el receptor opioide delta de mamíferos (Rodríguez et al., 2000, Neurosci Lett., 288(3):207- 210); ZFOR2 (actualmente ZfMOR), que presenta homología con el receptor opioide mu (Barrallo et al., 2000, Brain Res Mol Brain Res., 84(1-2): 1-6); ZFOR3 (actualmente ZfKOR), que presenta homología con el receptor opioide kappa (Alvarez et al., 2006, Neurosci Lett.,

405(1-2):94-99); ZFOR4 (actualmente ZÍDOR2), que es un duplicado de ZÍDOR1 y, por ello, presenta mayor homología con el receptor opioide delta (Piñal- Seoane et al., 2006, J Mol Endocrino!., 37(3):391-403) y ZfORL, que presenta homología con el receptor ORL (Rivas- Boyero et al., 2011, J Mol Endocrino!.).

El pez cebra (Danio rerio), un teleósteo originario del río Ganghes, se utiliza como modelo experimental para estudiar el desarrollo embrionario de los vertebrados ya que presenta una serie de ventajas sobre otros organismos que son utilizados como modelos experimentales, siendo relativamente fácil el manejo de sus embriones y la realización de sondeos genéticos que revelan las etapas y mecanismos de la embriogénesis.

Se ha señalado que el pez cebra es un sistema adecuado para determinar la funcionalidad de proteínas codificadas por el genoma humano, así como para estudiar el desarrollo del sistema nervioso e identificar anomalías metabólicas. En los últimos años el pez cebra está siendo utilizado como organismo modelo para el descubrimiento y validación de nuevas dianas farmacológicas, así como en estudios toxicológicos y en la búsqueda de nuevas drogas. Varios autores ya han propuesto al pez cebra como un modelo para el análisis biológico de los efectos de diversas drogas como el alcohol y la cocaína, obteniendo resultados parecidos a los encontrados en ratones. Anichtchik y colaboradores (Anichtchik et al., 2004, J Neurochem., 88(2):443-453) han demostrado que la administración de neurotoxinas catecolaminérgicas al pez cebra produce alteraciones neuroquímicas y comportamentales. Además, el pez cebra es un organismo en el que se pueden realizar análisis químicos de moléculas de bajo peso molecular, evitando el efecto materno que puede alterar los resultados si el mismo análisis se realiza sobre animales con desarrollo intrauterino. Por ello, este modelo es adecuado para realizar ensayos preclínicos frente a agentes tóxicos, y puesto que los embriones modifican su comportamiento tras la ingesta de alcohol o cocaína, el pez cebra podría ser utilizado como modelo para el estudio del fenómeno de adicción.

Existen controversias sobre los mecanismos que subyacen a la aparición y el desarrollo de tolerancia y dependencia a drogas de abuso. Parece claro que es necesario desarrollar nuevos modelos que aporten información sobre estos desafortunados efectos secundarios desde el punto de vista molecular, estructural, celular y de comportamiento. En este sentido se han realizado estudios sobre los efectos de la adicción a diferentes drogas utilizando el pez cebra como sistema modelo (Ninkovic y Bally-Cuif, 2006, Methods, 39(3):262-274).

El pez cebra puede ser un buen modelo para el estudio de los agentes... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Péptido aislado que consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.

2. Polinucleótido aislado que codifica para el péptido según la reivindicación 1.

3. Polinucleótido según la reivindicación 2 que consiste en la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 2.

4. Construcción genética que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3.

5. Construcción genética según la reivindicación 4 que es un vector de expresión.

6. Célula que comprende la construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5.

7. Método de obtención de anticuerpos policlonales específicos frente al receptor opioide tipo Deltal b de Danio rerio que comprende:

a. obtener el suero previamente extraído de un mamífero inmunizado con el péptido según la reivindicación 1, y

b. purificar los anticuerpos policlonales frente al receptor opioide tipo Deltalb de Danio rerio presentes en el suero obtenido en la etapa (a).

8. Método según la reivindicación 7 donde el mamífero es un conejo.

9. Suero que comprende anticuerpos policlonales específicos frente al receptor opioide tipo Deltal b de Danio rerio obtenible por el método según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8.

10. Anticuerpo específico frente al péptido según la reivindicación 1.

11. Anticuerpo según la reivindicación 10, donde el anticuerpo es policlonal y ha sido obtenido mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8.

12. Uso del suero según la reivindicación 9 o del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 para la detección del receptor opioide tipo Delta1b de Danio rerio.

13. Uso según la reivindicación 12, donde la detección del receptor opioide tipo Delta1b de Danio rerio se lleva a cabo mediante un ensayo inmunohistoquímico.

14. Uso según la reivindicación 13, donde el ensayo inmunohistoquímico se selecciona de la lista que consiste en: Western blot, ELISA o inmunofluorescencia.

15. Kit para la detección del receptor opioide tipo Delta1b de Danio rerio que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11.

16. Uso del kit según la reivindicación 15 para la detección del receptor opioide tipo Delta1b de Danio rerio.

17. Método de detección del receptor opioide tipo Delta1b de Danio rerio que comprende:

a. poner en contacto una muestra biológica aislada con el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11,

b. incubar la muestra biológica aislada y el anticuerpo del paso (a) durante un periodo de tiempo adecuado para que tenga lugar una respuesta inmunológica, y

c. determinar la presencia de respuesta inmunológica tras la incubación del paso (b).

18. Método según la reivindicación 17, donde la presencia de respuesta inmunológica en el paso (c) se determina mediante un ensayo inmunohistoquímico.

19. Método según la reivindicación 18, donde el ensayo inmunohistoquímico se selecciona de la lista que consiste en: Western blot, ELISA o inmunofluorescencia.