ANTICUERPO BIESPECIFICO ANTI-CANCER DE OVARIO HUMANO-ANTI-CD3.

Un anticuerpo biespecífico contra el cáncer de ovario, que se construye conectando mediante ingeniería genética un anticuerpo de cadena sencilla anti-cáncer de ovario y un anticuerpo de cadena sencilla anti-CD3 humano,

en el que el anticuerpo de cadena sencilla anti-CD3 humano se ha injertado con CDR a través de humanización, mediante un interconector,

en el que el interconector que conecta los dos anticuerpos Fv de cadena sencilla comprende la secuencia de aminoácidos:



en el que el dominio variable de cadena pesada de dicho scFv anti-ovario contiene la secuencia de aminoácidos:



en el que el dominio variable de cadena ligera de dicho scFv anti-ovario contiene la secuencia de aminoácidos:



en el que el dominio variable de cadena pesada de dicho scFv injertado con CDR anti-CD3 humano contiene la secuencia de aminoácidos:



y en el que el dominio variable de cadena ligera de dicho scFv injertado con CDR anti-CD3 humano contiene la secuencia de aminoácidos:

Anticuerpo biespecífico anti-cáncer de ovario humano-anti-CD3.

La presente invención se refiere a un anticuerpo biespecífico anti-cáncer construido mediante ingeniería genética, a las secuencias de nucleótidos que codifican dicho anticuerpo biespecífico, a los vectores de expresión que contienen dichas secuencias de nucleótidos y a células huéspedes que contienen los vectores.

A diferencia de los anticuerpos naturales, dos sitios de unión a antígeno de un anticuerpo biespecífico (BsAc) portan diferentes especificidades, por tanto, es de estructura química bivalente pero monovalente en la función de unión. Un BsAc dirigido frente a tanto antígenos asociados a tumores como moléculas activadoras en células efectoras puede reclutar las células efectoras inmunológicas en sitios tumorales de manera eficaz y activarlas para destruir células tumorales específicamente. Los BsAc son proteínas híbridas que pueden generarse mediante reticulación química, tecnología de hibridoma o procedimientos genéticos. En el procedimiento de reticulación química, dos clases de anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos se disociaron mediante agentes reductores para generar anticuerpos monovalentes y fragmentos de los mismos. El BsAc resultante se construye mediante reticulación química de dos anticuerpos monovalentes y fragmentos de los mismos procedentes de anticuerpos originales diferentes. Esta estrategia puede usarse para la producción rápida de BsAc a gran escala, aunque los BsAc pueden inactivarse algunas veces durante la reticulación y es difícil garantizar la homogeneidad de los productos. Otra estrategia para la producción de BsAc es la tecnología de hibridoma mediante la cual se fusionó una línea celular de hibridoma establecida que secretaba un anticuerpo monoclonal con células de bazo inmunizadas con el otro antígeno o se fusionaron entre sí dos líneas celulares de hibridoma establecidas que secretaban dos anticuerpos monoclonales diferentes para crear hibridomas híbridos. El primer hibridoma resultante se denomina hibridoma dimérico e hibridoma tetramérico. Generalmente, el BsAc producido mediante la tecnología de hibridoma mantiene altas bioactividades. Sin embargo, los procedimientos son tediosos y requieren mucho tiempo y no es fácil aislar un BsAc de otros anticuerpos inactivos y no deseados generados de manera simultánea. Estos formatos de BsAc encontraron otros problemas predecibles: los componentes murinos y de tamaño demasiado grande contenidos en el BsAc son inmunogénicos en pacientes e inducirán la producción de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA), lo que puede impedir volver a usar estos BsAc en la práctica clínica. Además, la producción y la purificación de estos formatos de BsAc son caros, lo que limita la aplicación de BsAc en la práctica clínica. La sustitución de estos procedimientos tradicionales por enfoques de recombinación génica ha acelerado el progreso en esta área. Basándose en la tecnología de anticuerpos moleculares pequeños, la producción de BsAc mediante ingeniería genética tiene ventajas con respecto a las descritas anteriormente, tales como la estabilidad del procedimiento, la producción a gran escala, el bajo coste y la facilidad de uso. La ingeniería genética ha conducido al desarrollo de diversos formatos de BsAc moleculares pequeños conectando dos clases diferentes de scFv. Hay tres clases de formatos de BsAc clasificados por las diferentes uniones. (1) Los mini-anticuerpos son heterodímeros ensamblados conectando dos fragmentos scFv entre sí con un dominio oligomerizado (por ejemplo, motivos de cremallera de leucina derivados de los factores de transcripción Fos o Jun). (2) Los diacuerpos son dímeros asociados de manera no covalente que se ensamblan mediante dos cadenas sencillas VH1-VL2 y VH2-VL1, conectadas ambas mediante un conector corto que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre dominios V de la misma cadena. Por tanto, cada cadena sola no puede unirse al antígeno, sino que la expresión conjunta de las dos cadenas (VH₁-VL₂ y VH₂-VL₁) conduce al ensamblaje de diacuerpos heterodiméricos que pueden unirse a dos clases de antígenos. (3) ScBsAc: se usó un interconector para conectar dos scFv diferentes con diferentes especificidades y se expresó ScBsAc en las células huésped como un único polipéptido. El intraconector entre dos dominios dentro de scFv es a menudo (Gly₄Ser)₃. Como para el interconector entre dos scFv, hay dos estrategias para diseñarlo. Para el fin de evitar un apareamiento falso entre regiones variables heterogéneas, el interconector es a menudo un conector peptídico corto menor de diez residuos de aminoácido tal como Gly4Ser. Otra estrategia es seleccionar un conector más largo para el interconector. En el laboratorio, un interconector con 25 aminoácidos denominado 205c', ideado por Gruber en la construcción de un scBsAc anti-TCR X anti-fluorescente, se mencionó para uno de los tres interconectores. Se idearon otros dos interconectores denominados Fc (26 residuos) y HSA, dando ambos como resultado el plegamiento apropiado de dos scFv y la formación de un BsAc con dos sitios de unión a antígeno con altas actividades. En pocas palabras, lo más importante para diseñar interconectores es garantizar el apareamiento apropiado entre dominios variables y el plegamiento de las proteínas, dando como resultado la formación de un BsAc que mantiene las actividades biológicas y la estabilidad. Deben introducirse algunas propiedades novedosas para facilitar la purificación y prolongar el tiempo de semivida plasmática.

La inmunoterapia mediada por BsAc desempeña un papel prometedor en la bioterapia clínica para tumores. Lo siguiente son dos características de BsAc. En primer lugar, los efectos de destrucción de tumores mediados por BsAc se basan en la estimulación del sistema inmunitario, sumamente específico con tumores y libre de restricción por el CMH. En segundo lugar, debido a la falta de dominio Fc, el BsAc es inocuo para tejidos normales. Por tanto, la terapia mediada por BsAc es la complementaria a procedimientos tradicionales tales como cirugía, radioterapia y quimioterapia. El efecto principal de este enfoque se basa en el aclaramiento de residuos subclínicos y en la prevención o eliminación de que el tumor experimente recidiva y metástasis. Un BsAc no sólo cura tumores, sino que también estimula el sistema inmunitario para proporcionar y mantener la protección inmunitaria durante un largo tiempo. Basándose en resultados de experimentos en ratones y en la práctica clínica, un BsAc preparado para su uso en ensayos debe tener al menos cinco características tal como sigue: ding{172} se dirige a los antígenos tumorales pertinentes con alta especificidad y afinidad; ding{173} puede unirse de manera monovalente a factores activadores en células efectoras-células citotóxicas y da como resultado reticulación sólo cuando BsAc se une a antígenos tumorales debido a la falta de dominio Fc; ding{174} los BsAc pueden promover la inflamación y citotoxicidad eficaces producidas selectivamente mediante el grupo correspondiente de leucocitos en los sitios tumorales; ding{175} los BsAc deben humanizarse para minimizar la inducción de respuesta humana anti-ratón tras usos repetidos; finalmente, ding{176} los BsAc no sólo deben ser suficientemente pequeños para penetrar en tumores sino también suficientemente grandes para mantenerse en la circulación durante un tiempo suficiente.

Basándose en estos puntos descritos anteriormente, se han desarrollado en los últimos años numerosos BsAc que activan a muchas clases de células efectoras inmunitarias y que se dirigen a diferentes células tumorales, incluyendo las células efectoras linfocitos T, células NK, monocitos, macrófagos, neutrófilos, células LAK (células citotóxicas activadas por linfoquina) y células TIL (linfocitos infiltrantes de tumores), etc. Las células T se reconocen comúnmente como las células específicas principales para las respuestas inmunitarias. CD3 expresado en la superficie de tolas las células T maduras es el marcador de superficie común para las células T. CD3 se une a TCR de manera no covalente, formando el complejo TCR-CD3 completo, y participa en respuestas inmunitarias contra el estímulo del antígeno. Actualmente, CD3 es la molécula activadora de superficie en células efectoras inmunitarias usada más ampliamente y de manera satisfactoria. Tras unirse un anticuerpo anti-CD3 dentro de BsAc a una molécula CD3 en la superficie de células T, se producirán numerosos...

1. Un anticuerpo biespecífico contra el cáncer de ovario, que se construye conectando mediante ingeniería genética un anticuerpo de cadena sencilla anti-cáncer de ovario y un anticuerpo de cadena sencilla anti-CD3 humano, en el que el anticuerpo de cadena sencilla anti-CD3 humano se ha injertado con CDR a través de humanización, mediante un interconector,

en el que el interconector que conecta los dos anticuerpos Fv de cadena sencilla comprende la secuencia de aminoácidos:

en el que el dominio variable de cadena pesada de dicho scFv anti-ovario contiene la secuencia de aminoácidos:

en el que el dominio variable de cadena ligera de dicho scFv anti-ovario contiene la secuencia de aminoácidos:

en el que el dominio variable de cadena pesada de dicho scFv injertado con CDR anti-CD3 humano contiene la secuencia de aminoácidos:

y en el que el dominio variable de cadena ligera de dicho scFv injertado con CDR anti-CD3 humano contiene la secuencia de aminoácidos:

2. Una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo biespecífico según la reivindicación 1.

3. La secuencia de nucleótidos según la reivindicación 2, comprendida en un vector de expresión.

4. Una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3.

5. La célula huésped según la reivindicación 4, que es E. coli.

6. Una composición farmacológica para el tratamiento y/o la prevención de tumores que comprende un anticuerpo biespecífico según la reivindicación 1.

7. La composición farmacológica según la reivindicación 6, en la que el tumor es cáncer de ovario.

8. Uso de un anticuerpo biespecífico según la reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de tumores.

9. El uso según la reivindicación 8, en el que el tumor es cáncer de ovario.