Una molécula de unión a antígeno capaz de unirse a PlGF, caracterizada porque comprende las regiones CDR que corresponden a las secuencias de SEQ ID NO: 17 a 22.

Anticuerpo anti-PlGF novedoso

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos novedosos y fragmentos y derivados de los mismos particularmente adecuados para la inhibición de la angiogénesis en estados patológicos. La invención también se refiere a líneas celulares que producen los anticuerpos específicos. La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos, fragmentos y/o derivados de la invención y proporciona métodos de prevención y tratamiento de la angiogénesis y/o permeabilidad vascular en las que éstas no se desean, tales como en la formación de tumores, enfermedades del ojo, hipertensión pulmonar y trastornos inflamatorios, y métodos de prevención y tratamiento de trastornos óseos, tales como osteoporosis.

Antecedentes de la invención

La formación anómala de vasos sanguíneos contribuye a la patogénesis de numerosas enfermedades con alta morbimortalidad. El esclarecimiento de los mecanismos que subyacen al crecimiento vascular podría permitir el desarrollo de estrategias terapéuticas para estimular el crecimiento vascular en tejidos isquémicos o para suprimir su formación en tumores. Recientes estudios de direccionamiento génico en embriones han identificado algunos de los mecanismos implicados en la formación inicial de canales endoteliales (angiogénesis) y su posterior maduración mediante cobertura con células de músculo liso (arteriogénesis) . Surgen pruebas de que mecanismos moleculares distintos pueden mediar el crecimiento de vasos sanguíneos durante estados patológicos, pero los actores moleculares siguen en gran medida sin determinarse.

Se ha establecido que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) está implicado en el desarrollo y crecimiento patológico de la vasculatura (Ferrara N. et al, 1999, Curr Top Microbiol Immunol 237, 1-30) . Además, también se ha mostrado que el factor de crecimiento placentario (PlGF) , un homólogo de VEGF, es un modulador específico de VEGF durante una variedad de estados patológicos, tales como retinopatía isquémica, tumorigénesis, trastornos inflamatorios y edema. Se ha mostrado que ratones PlGF-/- tienen una angiogénesis y arteriogénesis alteradas en la enfermedad (Carmeliet P. et al., 2000, J. Pathol. 190, 387 - 405) , mientras que la angiogénesis fisiológica en salud normal permanece no afectada. Por tanto, los inhibidores de PlGF tienen un gran potencial para el tratamiento de enfermedades en las que la angiogénesis o arteriogénesis contribuyen a la patogenicidad de la enfermedad.

Se conocen en la técnica inhibidores para PlGF, tales como un anticuerpo policlonal de cabra contra PlGF humano (R&D pharmaceuticals, Abingdon, RU) y un anticuerpo policlonal de pollo (Gassmann et al., 1990, Faseb J. 4, 2528) . Esos anticuerpos se usan para estudios de inmunotransferencia de tipo Western, histoquímica e inmunoprecipitación. El documento WO 01/85796 describe el uso de inhibidores de PlGF, incluyendo anticuerpos anti-PlGF monoclonales, para el tratamiento o la prevención de enfermedades, tales como formación de tumores. Más específicamente, se describe la preparación de anticuerpos monoclonales murinos que inhiben completamente la unión de PlGF-2 murino a su receptor Flt-1, mediante lo cual se selecciona el anticuerpo Mab-PL5D11 ya que tiene la actividad inhibidora más eficaz. Se describe el uso del anticuerpo en modelos animales de angiogénesis patológica.

Los anticuerpos generados en animales tienen características que pueden limitar gravemente su uso en terapia de seres humanos. Como proteínas foráneas, pueden provocar una respuesta anti-inmunoglobulina (que para los anticuerpos de ratón se denomina anticuerpo anti-ratón humano o HAMA) que reduce o destruye su eficacia terapéutica y/o provoca reacciones alérgicas o de hipersensibilidad en pacientes, tal como enseñan Jaffers et al., 1986 (Transplantation 1986 41:572) . Aunque el uso de anticuerpos monoclonales humanos abordaría esta limitación, se ha demostrado que es difícil generar grandes cantidades de anticuerpos anti-ser humano humanos mediante la tecnología de hibridoma convencional. Por tanto, se ha usado en la técnica la tecnología recombinante para construir anticuerpos "humanizados" que mantienen la alta afinidad de unión de los anticuerpos animales, tales como anticuerpos monoclonales murinos pero que presentan inmunogenicidad reducida en seres humanos. Particular, se han sugerido anticuerpos quiméricos en los que la región variable (V) de un anticuerpo no humano se combina con la región constante (C) de un anticuerpo humano. Se describen en detalle métodos de obtención de tales inmunoglobulinas quiméricas en la patente de EE.UU. 5.770.198. En otros intentos de reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos murinos, solamente la región determinante de complementariedad (CDR) , es decir, regiones de hipervariabilidad en las regiones V, en vez del dominio V completo, se trasplantan a un anticuerpo humano. Tales anticuerpos humanizados se conocen como anticuerpos injertados con CDR. La construcción de anticuerpos injertados con CDR que reconocen antígenos más complejos ha dado como resultado anticuerpos que tienen una actividad de unión significativamente inferior que los anticuerpos no humanizados nativos. En numerosos casos, se demostró que la simple introducción de CDR no humanas en una estructura principal de anticuerpo humano es insuficiente para mantener la actividad de unión completa. Aunque se requiere un modelo informático refinado del anticuerpo murino de interés con el fin de identificar aminoácidos críticos que van a considerarse en el diseño de un anticuerpo humanizado, y se propusieron directrices teóricas generales para tal diseño, en todos los casos el procedimiento debe adaptarse y optimizarse para el anticuerpo no humano particular de interés.

Posteriormente, sigue habiendo una necesidad de anticuerpos (monoclonales) que inhiban óptimamente la unión de PlGF humano a su receptor. Además, también es necesario que tales anticuerpos no sean inmunogénicos, porque no puedan provocar HAMA (o tengan una baja tendencia a hacerlo) .

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal novedoso dirigido a PlGF y que puede inhibir la unión de PlGF a su receptor tal como se define en las reivindicaciones. Los presentes ligandos son los primeros en demostrar inhibición de PlGF humano en un estado patológico in vivo. Más específicamente, los anticuerpos y derivados de los mismos según la presente invención pueden reducir el tamaño tumoral y la vascularización de tejido tumoral humano in vivo. Los anticuerpos de la presente invención proporcionan una alternativa a las terapias antiangiogénicas que seleccionan como diana VEGF usadas actualmente, con la importante ventaja de que los efectos secundarios provocados por la inhibición de la angiogénesis fisiológica asociada con estas terapias se reducen significativamente.

La presente descripción se refiere a moléculas de unión a antígeno, particularmente anticuerpos monoclonales, fragmentos o derivados de los mismos, incluyendo anticuerpos humanizados y fragmentos de anticuerpo, que se unen al mismo epítopo de PlGF que el anticuerpo denominado 16D3 en el presente documento.

Se dan a conocer anticuerpos monoclonales novedosos que pueden unirse a PlGF y que tienen la capacidad para inhibir el funcionamiento de PlGF, más específicamente anticuerpos que se caracterizan porque su región variable de cadena pesada comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene al menos el 80%, más particularmente al menos el 90%, lo más particularmente el 95% de identidad de secuencia con la misma dentro de las regiones CDR y/o porque su región variable de cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tiene al menos el 80%, particularmente al menos el 85%, más particularmente al menos el 90%, lo más particularmente al menos el 95% de identidad de secuencia con la misma dentro de las regiones CDR, tales como el anticuerpo 16D3 o derivados del mismo. Adicional o alternativamente, en una realización adicional, las moléculas de unión a antígeno de la presente invención tienen una identidad de secuencia dentro de las regiones variables de cadena ligera y/o pesada fuera de las regiones CDR que es al menos del 70%, particularmente al menos el 80%, más particularmente al menos el 90%, lo más particularmente al menos el 95% idéntica a las secuencias de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, respectivamente.

Según una realización particular de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado,... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de unión a antígeno capaz de unirse a PlGF, caracterizada porque comprende las regiones CDR que corresponden a las secuencias de SEQ ID NO: 17 a 22.

2. La molécula de unión a antígeno según la reivindicación 1, que es una molécula seleccionada del grupo de Fab, Fab‘ o F (ab') 2, una combinación de al menos dos regiones determinantes de complementariedad (CDR) , una parte variable de cadena sencilla anclada a la membrana o soluble o un dominio variable sencillo.

3. La molécula de unión a antígeno según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 y porque comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4.

4. La molécula de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es el anticuerpo 16D3 tal como se produce por la línea celular depositada como LMBP 6399CB o un fragmento del mismo.

5. La molécula de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo.

6. La molécula de unión a antígeno según la reivindicación 1, que es un fragmento variable de cadena sencilla.

7. La molécula de unión a antígeno según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

8. La molécula de unión a antígeno según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.

9. Una línea celular que produce una molécula de unión a antígeno según la reivindicación 1.

10. La línea celular según la reivindicación 9, que es la línea celular depositada como LMBP 6399CB.

11. Una composición farmacéutica que comprende como principio activo una molécula de unión a PlGF según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.

12. La composición farmacéutica según la reivindicación 11, que comprende además una cantidad terapéuticamente eficaz de otro agente antiangiogénico.

13. Un polinucleótido que codifica para una molécula de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

14. El uso de la molécula de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la selección de compuestos con un efecto aditivo a la inhibición de PlGF en el tratamiento de cáncer.

15. El uso de la molécula de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, como herramienta de diagnóstico in vitro.

16. El uso de la molécula de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la selección de moléculas de unión a antígeno capaces de unirse al mismo epítopo de PlGF.

17. Un método de selección de moléculas de unión a antígeno capaces de unirse al mismo epítopo de PlGF que el anticuerpo 16D3 de la reivindicación 4, que comprende las etapas de:

- a) proporcionar una molécula de unión a PlGF y

- b) seleccionar una molécula de unión a PlGF capaz de unirse al mismo epítopo de PlGF que el anticuerpo 16D3 basándose en la reactividad con dicho epítopo o basándose en la competición con el anticuerpo 16D3.

18. Una molécula de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un polinucleótido según la reivindicación 13, para uso en el tratamiento y/o la prevención de la angiogénesis no deseada en un estado patológico en un mamífero.

19. La molécula de unión a antígeno o polinucleótido según la reivindicación 18, en el que el estado patológico se selecciona del grupo que consiste en cáncer, inflamación, formación de adhesión, enfermedades del ojo, hipertensión pulmonar y permeabilidad vascular.

20. La molécula de unión a antígeno o el polinucleótido según la reivindicación 19, en el que dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer pancreático y melanomas.