ANTICUERPO ANTI-EPCAM Y USOS DEL MISMO.

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales anti-EpCAM humana y derivados funcionales de los mismos, a procedimientos y materiales para obtenerlos, al uso de dicho anticuerpos para el diagnóstico y el tratamiento de tumores que expresan EpCAM y a materiales que comprenden dichos anticuerpos adecuados para su uso en el campo médico. Antecedentes de la invención ES 2 367 675 T3 La elección como diana de tejidos tumorales por anticuerpos que puede reconocer selectivamente antígenos expresados en exceso en el sitio tumoral es el objetivo de todas las inmunoterapias antitumorales. La molécula de adhesión a células epiteliales (EpCAM, nº de Swiss Prot P16422) también conocida como el transductor 1 de la señal de calcio asociado a tumor, TROP-1, GA733-2, etc., es una glicoproteína de la transmembrana de tipo I expresada en la membrana basolateral sobre simples epitelios en los que participa en la adhesión a células hemofílicas independientes de calcio. El dominio extracelular consiste en un factor de crecimiento epidérmico como repetición, seguido de una repetición de tiroglobulina y una región pobre en cisteína, mientras que el dominio intracelular tiene 26 aminoácidos de longitud y hay dos sitios de unión a -actinina para el enlace al citoesqueleto de actina (Winter MJ y col. 2003). Las células de tumores malignos humanos graves expresan fuertemente en exceso EpCAM como se ha confirmado recientemente por Went y colaboradores (2006) que informaron de los resultados de inmunohistoquímica obtenidos en un gran número de especímenes de tumor de colon, gástrico, próstata y pulmón. Las células que expresan en exceso EpCAM tienden a segregarse de células normales, guardando relación con el desarrollo de un fenotipo proliferativo y maligno (Winter y col., 2003). Basándose en estos datos se exploró la posibilidad de elegir EpCAM como diana para inmunoterapia. Un anticuerpo IgG2a murino, edrecolomab, con algo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) hacia células positivas para EpCAM, se autorizó en Alemania para uso clínico y se empleó para el tratamiento de pacientes con carcinoma colorrectal o pancreático que se habían sometido a cirugía curativa. Un resultado del seguimiento de siete años de enfermedad residual mínima después del tratamiento con edrecolomab en pacientes con cáncer colorrectal de Dukes C mostró una mortalidad reducida del 32% y una disminución en la tasa de reaparición del 23% (Riethmuller G y col., 1998; Weiner LM y col., 1993). Sin embargo, los resultados globales del estudio clínico conducen a la retirada de este fármaco como monoterapia debido a su eficacia antitumoral limitada (Punt CJ y col., 2002) y a la promoción de nuevos ensayos clínicos en los que el anticuerpo está previsto en ámbitos de adyuvante con otros compuestos quimioterapéuticos activos (Frodin JE y col., 2002). Se han usado otros anticuerpos contra esta diana en entornos preclínicos o clínicos. MT-201 (adecatumumab) es un anticuerpo monoclonal IgG1 completamente humano con afinidad moderada por EpCAM (Naundorf S y col., 2002). Su eficacia se demostró en el modelo de xenoinjerto de ratón sin pelo usando la línea de células de cáncer de colon HT-29 (Naundorf S y col., 2002). Estudios in vitro sobre diversas líneas celulares de tumor han mostrado que MT201 media en la lisis de la célula diana por ADCC y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (Prang N y col., 2005). Este anticuerpo está actualmente en desarrollo clínico para el tratamiento de cáncer de próstata resistente a hormonas (Oberneder R y col., 2006). ING-1 es un anticuerpo monoclonal manipulado por ingeniería de alta afinidad humano que elige células positivas para EpCAM como diana. Se ha usado en un ensayo clínico de fase I en pacientes con adenocarcinomas avanzados, resistentes a terapia convencional, y los datos de este estudio sugirieron que los anticuerpos con alta afinidad por EpCAM, aunque eran más citotóxicos para células tumorales, también podían inducir lesión tóxica pancreática rápida, limitándose así su ventana terapéutica para administración sistémica (De Bono JS y col., 2004). Hay opiniones divergentes sobre la relevancia de la afinidad por anticuerpos para la eficacia de la inmunoterapia. Velders y col. (1998) presentaron datos in vitro sobre el impacto de la afinidad de anticuerpos y la densidad de antígenos sobre ADCC como se ha obtenido por comparación de dos anticuerpos que tienen afinidad diferente por EpCAM. Los datos obtenidos de este estudio revelaron que el anticuerpo de alta afinidad podría mediar en la destrucción celular con bajos niveles de expresión de antígenos o, a niveles de unión comparables, con mayor eficacia. Como la heterogeneidad de una expresión de antígeno diana es una característica común de todos los tumores, el uso de anticuerpos de alta afinidad podría mejorar los resultados clínicos. Los posibles efectos tóxicos sistémicos asociados al uso terapéutico de anticuerpos anti-EpCAM de alta afinidad podrían reducirse mediante estrategias de elección de diana previa que incluyen una etapa de persecución para eliminar, en un momento dado, el anticuerpo en circulación. Alternativamente, el uso de anticuerpos anti-EpCAM de alta afinidad podría limitarse a tratamientos loco-regionales. Se ha desarrollado un fragmento de anticuerpo Fv monocatenario humano, NR-LU-10, específico para el antígeno de EpCAM, manipulado genéticamente como una proteína de fusión de estreptavidina para la radioinmunoterapia de elección de diana previa o cirugía de mama radioinmunoguiada. Los datos preclínicos mostraron que una dosis 2 única de 800 µCi de 90Y-DOTA-biotina administrada después de NR-LU-10 curó ratones con xenoinjerto de cáncer de pulmón de células pequeñas humano subcutáneo establecido (Goshorn S y col., 2001). En un segundo informe de Burak WE Jr y col. (2001), el uso del Fab NR-LU-10 marcado fue útil en sondaje intraoperativo para revelar la localización de tumores en 7 de 10 pacientes, confirmándose así su capacidad como agente de elección de diana. A pesar del éxito clínico de anticuerpos monoclonales en varias patologías, la inmunoterapia de tumores sólidos todavía sigue siendo insatisfactoria. La radioinmunoterapia guiada de anticuerpos elegidos como diana previa Pretargeted Antibody Guided RadioImmunoTherapy (PAGRIT ) es un enfoque de múltiples tratamientos que permite la acumulación restringida y amplificada del radioisótopo en el tumor. La especificidad y la afinidad del anticuerpo monoclonal antitumoral, usado como primera etapa, es fundamental para la eficacia del tratamiento. El solicitante informó de acumulación excepcionalmente alta y específica del anticuerpo monoclonal anti-tenascina ST2146 en tumores xenotrasplantados humanos que expresan tanto alto como bajo antígeno (De Santis y col., Clinical Cancer Research, pág. 2191, 1 de abril de 2006). Basándose en la enseñanza del documento EP 0 496 074, G. Paganelli y col. desarrollaron este enfoque de elección de diana previa de etapas para el tratamiento sistémico y loco-regional de tumores (Cremonesi M. y col., Eur. J. Nucl. Med, 26 (2): 110-120, 1999; Paganelli G. y col., Eur. J. Nucl. Med. 26 (4): 348-357, 1999; Paganelli G. y col., Cancer Biother. & Radiopharm. 16 (3): 227-235,2001). Otras referencias al procedimiento de elección de diana previa de tres etapas son los documentos WO 94/04702 y US 5.578.287. El tratamiento de elección de diana previa de tres etapas se basa en la administración secuencial intravenosa de un anticuerpo monoclonal anti-tenascina biotinilado, estreptavidina y biotina marcada con 90 Y con dos administraciones de persecución de avidina y albúmina biotinilada antes de la estreptavidina y la biotina marcada con 90 Y, respectivamente, para reducir el fondo no específico. En el campo médico existe la necesidad de anticuerpos anti-EpCAM adicionales y mejorados útiles en el diagnóstico y la terapia del cáncer tales como, por ejemplo, en el enfoque PAGRIT. Resumen de la invención ES 2 367 675 T3 La presente invención se refiere a un anticuerpo y fragmentos de anticuerpos que también pueden contener restos adicionales y agentes de diagnóstico, composiciones que contienen estos anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, y composiciones de diagnóstico y terapéuticas que los contienen, a su uso en terapia y diagnósticos y procedimientos de preparación de estos anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. Es un objeto de la presente invención un anticuerpo anti-EpCAM o un derivado funcional del mismo, en el que la región variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende las tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que tienen la secuencia SEC ID Nº 2; SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 6 y en el que la región variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende las tres regiones determinantes... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo anti-EpCAM o un derivado funcional del mismo en el que la región variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende las tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que tienen la secuencia de SEC ID Nº 2; SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 6 y en el que la región variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende las tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que tienen la secuencia SEC ID Nº 8; SEC ID Nº 10 y SEC ID Nº 12. 2. El anticuerpo anti-EpCAM o derivado funcional del mismo según la reivindicación 1 que puede inhibir completamente y permanentemente el crecimiento de tumores que expresan EpCam. 3. El anticuerpo anti-EpCAM según la reivindicación 2 que es un anticuerpo monoclonal, un fragmento scFv, Fv, un fragmento Fab, un fragmento F(ab)2, un anticuerpo multimérico, un péptido o un fragmento proteolítico que contiene la región de unión a epítope, o anticuerpo quimérico, fusionado con otra proteína o ligado a un agente o un marcador; o un anticuerpo humano o humanizado. 4. El anticuerpo anti-EpCAM según la reivindicación 3, en el que el anticuerpo monoclonal se produce por la línea celular de hibridoma depositada según el Tratado de Budapest en el Centro de Biotecnología Avanzada, Génova, Italia, con el nº PD06004, o en el que la proteína quimérica es un quimera de ratón-ser humano o en el que la proteína de fusión comprende una citocina, una proteína de la familia de la avidina, biotina, biotina marcada u otras proteínas efectoras. 5. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o derivados funcionales del mismo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes o que consiste en una secuencia degenerada del mismo. 6. El ácido nucleico según la reivindicación 5 que comprende al menos una de las siguientes secuencias: SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 9 y SEC ID Nº 11. 7. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6. 8. Una célula huésped aislada transformada con el vector de expresión según la reivindicación 7. 9. Una línea celular de hibridoma productora del anticuerpo anti-EpCAM según la reivindicación 1 a 4. 10. La línea celular de hibridoma según la reivindicación 9 que es el hibridoma depositado según el Tratado de Budapest en el Centro de Biotecnología Avanzada, Génova, Italia, con el nº PD06004. 11. El anticuerpo anti-EpCAM de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso como un medicamento. 12. El anticuerpo anti-EpCAM de la reivindicación 11 para su uso como un medicamento antitumoral, en particular el tumor se selecciona del grupo de: carcinoma de colon, carcinoma de mama, carcinoma gástrico, carcinoma de ovario, carcinoma de vejiga urinaria o carcinoma de pulmón. 13. Uso del anticuerpo anti-EpCAM de las reivindicaciones 1 a 4 en diagnósticos in vitro. 14. El anticuerpo anti-EpCAM de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en diagnósticos in vivo. 15. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del anticuerpo o derivados del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. 16. La composición farmacéutica de la reivindicación 15 para radioinmunoterapia. 17. La composición farmacéutica según la reivindicación 15 ó 16 que comprende, en la misma dosis unitaria o por separado, al menos otro anticuerpo específico para tumor, en particular el anticuerpo específico para tumor es un anticuerpo contra EpCAM diferente del anticuerpo de las reivindicaciones 1 a 4. 18. Una composición soluble inyectable para diagnósticos tumorales in vivo que comprende el anticuerpo anti- EpCAM según la reivindicación 14. 19. Un procedimiento para inmunodetectar en una muestra un antígeno que puede unirse al anticuerpo o derivado del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende la etapa de incubar en condición apropiada la muestra con el anticuerpo o derivado del mismo según las reivindicaciones 1 a 4 para obtener un inmunocomplejo, y detectar el inmunocomplejo. 20. Un kit de diagnóstico para el procedimiento según la reivindicación 19 que comprende un anticuerpo o derivado del mismo según la reivindicación 1 a 4 y medios de detección de inmunocomplejos. 18 ES 2 367 675 T3 19 ES 2 367 675 T3 ES 2 367 675 T3 21 ES 2 367 675 T3 22 ES 2 367 675 T3 23 ES 2 367 675 T3 24 ES 2 367 675 T3 ES 2 367 675 T3 26 ES 2 367 675 T3 27