ANALOGOS DE HORMONAS GLICOPROTEINICAS ENTRELAZADAS POR DISULFURO, SU PREPARACION Y USO.

Hormonas glicoproteínicas, que consisten en una subunidad alfa y una subunidad ß,

seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) gonadotropina coriónica humana (hCG) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad alfa está modificada para sustituir el resto Cys7 por serina, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad ß está modificada para sustituir el resto Tyr37 por cisteína, para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre un resto Cys31 nativo de dicha subunidad alfa y el resto 37 de dicha subunidad ß, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad ß está opcionalmente más modificada para sustituir los restos 101-114 por los restos 95-108 de la subunidad ß de la hFSH;

(b) gonadotropina coriónica humana (hCG) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad alfa está modificada para sustituir el resto Val76 por cisteína, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad ß está modificada para sustituir el resto Val44 por cisteína para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre el resto 76 de dicha subunidad alfa y el resto 44 de dicha subunidad ß;

(c) hormona humana estimulante del folículo (hFSH) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad ß está modificada para sustituir el resto Tyr31 por cisteína, y en que o bien

(i) la secuencia de aminoácidos de la subunidad alfa está modificada para sustituir el resto Cys7 por serina; o bien

(ii) la secuencia de aminoácidos de la subunidad alfa está modificada para sustituir el resto Cys7 por alanina; para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre un resto Cys31 nativo de dicha subunidad alfa y el resto 31 de dicha subunidad ß; y

(d) hormona humana estimulante del folículo (hFSH) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad alfa está modificada para sustituir el resto Val76 por cisteína, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad ß está modificada para sustituir el resto Val38 por cisteína para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre el resto 76 de dicha subunidad alfa y el resto 38 de dicha subunidad ß

Análogos de hormonas glicoproteínicas entrelazadas por disulfuro, su preparación y uso.

Antecedentes del invento

El presente invento se refiere a hormonas glicoproteínicas y a su preparación y su uso. Más específicamente, el invento se refiere a hormonas glicoproteínicas entrelazadas por enlaces disulfuro y a su preparación y su uso.

Las hormonas glicoproteínicas incluyen las hormonas gonadotropina coriónica (CG; del inglés, chorionic gonado- tropin), también conocida como coriogonadotropina, hormona luteinizante (LH; del inglés, luteinizing hormone), también conocida como lutropina, hormona estimulante del folículo (FSH; del inglés, follicle stimulating hormone), también conocida como folitropina, y hormona estimulante del tiroides (TSH; del inglés, thyroid stimulating hormone), también conocida como tirotropina. Las de seres humanos son conocidas como gonadotropina coriónica humana (hCG), hormona luteinizante humana (hLH), hormona humana estimulante del folículo (hFSH) y hormona humana estimulante del tiroides (hTSH). Estas hormonas ejercen papeles importantes en las funciones gonadal y tiroidea (Pierce et al., 1981; Moyle et al., 1995). La CG y la LH se unen a, y estimulan, los receptores de LH, la FSH se une a, y estimula, los receptores de FSH, y la TSH se une a, y estimula, los receptores de TSH. La CG es una hormona producida en grandes cantidades principalmente por las placentas de unos pocos mamíferos, incluyendo las de primates. Las secuencias de aminoácidos de las subunidades ß de la CG de primates difieren normalmente de las de la LH. Los caballos también producen una CG; sin embargo, ésta tiene la misma secuencia de aminoácidos que la LH equina (Murphy et al., 1991).

Conforme a la revisión de Pierce et al. (1981), las hormonas glicoproteínicas son heterodímeros que consisten en una subunidad a y una subunidad ß. Los heterodímeros no están covalentemente unidos entre sí, y sus subunidades pueden ser disociadas mediante el tratamiento de las hormonas con ácido o urea (Pierce et al., 1981). La mayor parte de los vertebrados superiores sólo contienen un gen que codifica la subunidad a (Fiddes et al., 1.984); la misma subunidad a se combina normalmente con las subunidades ß de LH, FSH, TSH y, cuando está presente, CG. No obstante, el procesamiento proteico posterior a la traducción, notablemente la glicosilación (Baenziger et al., 1988), puede contribuir a diferencias en las composiciones de las subunidades a de LH, FSH, TSH y CG. La mayor parte de las diferencias de secuencia de aminoácidos entre las hormonas radica en sus subunidades ß específicas de la hormona (Pierce et al., 1981). Éstas se producen a partir de genes separados (Fiddes et al., 1984; Bo et al., 1992).

Con pocas excepciones (Blithe et al., 1991), los a,ß-heterodímeros presentan mucha más actividad hormonal que cada subunidad libre (Pierce et al., 1981). Las subunidades a y ß presentes en la naturaleza forman mucho mejor a,ß-heterodímeros que a,a-homodímeros o ß,ß-homodímeros. En realidad, la expresión conjunta de los genes de la subunidad a y la subunidad ß de hCG en células de mamífero conduce a la formación de a,ß-heterodímeros, monómeros de subunidad a y monómeros de subunidad ß. Las células sólo crean o secretan cantidades mínimas, si las hubiera, del a,a-homodímero o el ß,ß-homodímero.

Dos laboratorios (Lapthorn et al., 1994; Wu et al., 1994) han presentado estructuras cristalinas de alta resolución de la gonadotropina coriónica humana (hCG) por rayos X. Estas estructuras revelaron que los propuestos patrones originales de enlaces disulfuro (Mise et al., 1980 y 1981) eran incorrectos y que la hormona es un miembro de la familia de proteínas con nudos de cisteínas (Sun et al., 1995). Puesto que las posiciones relativas de las cisteínas son similares en todas las hormonas glicoproteínicas, es probable que tengan la arquitectura de nudos de cisteínas hallada en la hCG.

Las posiciones de los restos de cisteína en las subunidades a de las hormonas glicoproteínicas de vertebrados son similares (Figuras 1A y 1B). Usando la subunidad a de hCG como modelo, se ve que el nudo de cisteínas está formado por las cisteínas segunda, tercera, quinta, séptima, octava y novena de la subunidad a. Esto crea tres grandes bucles en la subunidad a (Figuras 1A y 1B). El bucle 1 es la secuencia de aminoácidos entre las cisteínas segunda y tercera; el bucle 2 es la secuencia de aminoácidos entre las cisteínas quinta y séptima de la subunidad a; y el bucle 3 es la secuencia de aminoácidos entre las cisteínas séptima y octava. Las posiciones de los restos de cisteína en las subunidades ß de las hormonas glicoproteínicas de vertebrados son similares (Pierce et al., 1981). Usando la subunidad ß de hCG como modelo, se ve que el nudo de cisteínas está formado por las cisteínas primera, cuarta, quinta, sexta, octava y novena. Esto crea tres grandes bucles en la subunidad ß (Figuras 2A y 2B). El bucle 1 es la secuencia de aminoácidos entre las cisteínas primera y cuarta; el bucle 2 es la secuencia entre las cisteínas quinta y sexta; y el bucle 3 es la secuencia entre las cisteínas sexta y octava. Sustituyendo porciones de la subunidad a por porciones homólogas de otra subunidad a o sustituyendo porciones de la subunidad ß por porciones homólogas de otra subunidad ß, es posible preparar quimeras funcionales de cada subunidad de hormona glicoproteínica (Campbell et al., 1991; Moyle et al., 1990; Moyle et al., 1994; Cosowsky et al., 1995; Moyle et al., 1995; Cosowsky et al., 1997). En la Figura 1C se presenta un esquema general de los elementos estructurales de las subunidades de hormonas glicoproteínicas, y en la Tabla 1A siguiente se muestra la correspondencia con subunidades de hormonas glicoproteínicas humanas por restos de aminoácido.

Además de su nudo de cisteínas, la subunidad ß contiene también una secuencia denominada "cinturón de seguridad" (Lapthorn et al., 1994) que está enrollada alrededor del segundo bucle de la subunidad a. El cinturón de seguridad comienza en la novena cisteína, el último resto del nudo de cisteínas de la subunidad ß, e incluye las cisteínas décima, undécima y duodécima. Está fijado al primer bucle de la subunidad ß por un enlace disulfuro entre la cisteína doce (es decir, en el extremo carboxílico terminal del cinturón de seguridad) y la cisteína tres (es decir, en el primer bucle de la subunidad ß).

El cinturón de seguridad es una porción de la subunidad ß de hCG que ejerce una significativa (si no esencial) influencia sobre la capacidad de hCG para distinguir los receptores de LH y FSH (Campbell et al., 1991; Moyle et al., 1994). La sustitución de toda la secuencia de aminoácidos del cinturón de seguridad de hCG, o de partes de ella, por la secuencia del cinturón de seguridad hallada en hFSH alteró la especificidad del compuesto hormonalmente análogo resultante en cuanto a la unión al receptor. Normalmente, la hCG se une a los receptores de LH más de 1.000 veces mejor que a los receptores de FSH o TSH. Sin embargo, compuestos análogos de hCG tales como CF94-117 y CF101-109 en que los restos 101-109 del cinturón de seguridad de hCG (es decir, Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-His-Pro-Leu-Thr) están sustituidos por sus restos correspondientes de hFSH (es decir, Thr-Val-Arg-Gly-Leu-Gly-Pro-Ser-Tyr) se unían a los receptores de FSH mucho mejor que la hCG (Moyle et al., 1994). Además, manipulando la composición del cinturón de seguridad, es posible preparar compuestos análogos de hCG que tengan diversos grados de actividades LH y FSH (Moyle et al., 1994; Han et al., 1996). Éstos presentan posibles usos terapéuticos importantes para potenciar la fecundidad en machos y hembras.

La mayoría de los enlaces disulfuro intrasubunitarios de las hormonas glicoproteínicas, aunque no todos, son esenciales para sus actividades biológicas. Estudios en que se han sustituido cisteínas individuales por otros aminoácidos, notablemente alanina, han mostrado que todos los...

1. Hormonas glicoproteínicas, que consisten en una subunidad a y una subunidad ß, seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) gonadotropina coriónica humana (hCG) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad a está modificada para sustituir el resto Cys7 por serina, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad ß está modificada para sustituir el resto Tyr37 por cisteína, para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre un resto Cys31 nativo de dicha subunidad a y el resto 37 de dicha subunidad ß, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad ß está opcionalmente más modificada para sustituir los restos 101-114 por los restos 95-108 de la subunidad ß de la hFSH;

(b) gonadotropina coriónica humana (hCG) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad a está modificada para sustituir el resto Val76 por cisteína, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad ß está modificada para sustituir el resto Val44 por cisteína para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre el resto 76 de dicha subunidad a y el resto 44 de dicha subunidad ß;

(c) hormona humana estimulante del folículo (hFSH) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad ß está modificada para sustituir el resto Tyr31 por cisteína, y en que o bien

(i)        la secuencia de aminoácidos de la subunidad a está modificada para sustituir el resto Cys7 por serina; o bien

(ii)        la secuencia de aminoácidos de la subunidad a está modificada para sustituir el resto Cys7 por alanina;

para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre un resto Cys31 nativo de dicha subunidad a y el resto 31 de dicha subunidad ß; y

(d) hormona humana estimulante del folículo (hFSH) en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad a está modificada para sustituir el resto Val76 por cisteína, y en que la secuencia de aminoácidos de la subunidad ß está modificada para sustituir el resto Val38 por cisteína para formar un enlace disulfuro intersubunitario entre el resto 76 de dicha subunidad a y el resto 38 de dicha subunidad ß.

2. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de la hormona glicoproteínica de acuerdo con la reivindicación 1, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, que es un líquido.

4. La composición farmacéutica de la reivindicación 3, que es estable.

5. Una molécula de DNA recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una subunidad a de la hormona glicoproteínica de la reivindicación 1.

6. Una molécula de DNA recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una subunidad ß de la hormona glicoproteínica de la reivindicación 1.

7. La molécula de DNA recombinante de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, que es un vector de expresión.

8. Una célula huésped eucariótica transformada con la molécula de DNA recombinante de la reivindicación 7, en que dicha célula huésped es capaz de expresar dicha subunidad de una hormona glicoproteínica.

9. Un procedimiento para preparar una hormona glicoproteínica de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las operaciones de:

cultivar una célula huésped eucariótica transformada con secuencias de nucleótidos de las subunidades a y ß, conducidas en el mismo vector de expresión o en vectores de expresión distintos;

hacer que se exprese la hormona glicoproteínica; y

recuperar la hormona glicoproteínica expresada.