Métodos para el análisis de trastornos proliferativos celulares.

Un método para detectar y/o clasificar el carcinoma colorrectal en un sujeto que comprende determinar la presencia o ausencia de metilación CpG de FOXL2 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto en donde la hipermetilación CpG de FOXL2 es indicativa de la presencia o clase de dicho carcinoma colorrectal

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Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E08021839.

Solicitante: EPIGENOMICS AG.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: Geneststrasse 5 10829 Berlin ALEMANIA.

Inventor/es: DISTLER, JURGEN, DR., SCHUSTER, MATTHIAS, TETZNER,REIMO, LESCHE,RALF, SLEDZIEWSKI,ANDREW, HILDMANN,THOMAS, MODEL,FABIAN, SONG,XIAOLING, LOFTON-DAY,Cathy.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)

PDF original: ES-2533767_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Métodos para el análisis de trastornos proliferativos celulares Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para detectar y/o clasificar el carcinoma colorrectal en un sujeto que comprende determinar la presencia o ausencia de metilación CpG de FOXL2 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto en donde la hipermetilación CpG de FOXL2 es indicativa de la presencia o clase de dicho carcinoma colorrectal.

Antecedentes

Incidencia y diagnóstico de cáncer. El cáncer es la segunda causa principal de muerte de los Estados Unidos. Las tasas de mortalidad se podrían mejorar significativamente si los métodos de detección actuales se mejoraran en términos de facilidad de detección, sensibilidad y conformidad del paciente. Los métodos actuales que se recomiendan para el diagnóstico de cáncer frecuentemente son caros y no son adecuados para su aplicación como pruebas de detección a gran escala para la población.

El cáncer hepatocelular (HCC) es el cuarto cáncer más común en el mundo, su incidencia varía de 2.1 por 100,000 en Norteamérica a 80 por 100,000 en China. En los Estados Unidos, se estima que habrá 17,550 nuevos casos diagnosticados en 2005 y 15,420 muertes por esta enfermedad. La ecografía del hígado, alfafetoproteína y CT convencional se obtienen regularmente en la evaluación diagnóstica del FICC (cáncer hepatocelular o cáncer primario de hígado), pero frecuentemente son demasiado insensibles para detectar pequeñas lesiones multifocales y para la planificación del tratamiento.

En los Estados Unidos la incidencia anual de cáncer colorrectal es de aproximadamente 150,000, y 56,600 personas mueren de cáncer colorrectal cada año. El riesgo de cáncer colorrectal en la población general es de aproximadamente 5 a 6 por ciento. A pesar de los intensos esfuerzos de los últimos años en la revisión y la detección precoz del cáncer de colon, hasta hoy en día la mayoría de los casos se diagnostican en una etapa avanzada con metástasis regional o distante. Aunque las opciones terapéuticas incluyen cirugía y quimioterapia adyuvante o paliativa, la mayoría de los pacientes mueren a causa de la progresión de su cáncer en unos meses. La identificación de los cambios moleculares que subyacen en el desarrollo del cáncer de colon puede ayudar a desarrollar nuevos controles, detección, diagnóstico y opciones terapéuticas que pueden mejorar el mal pronóstico global de estos pacientes.

Las directrices actuales para la detección colorrectal según la Sociedad Americana del Cáncer utiliza una de cinco opciones diferentes para el examen en personas de riesgo promedio de 50 años de edad o más. Estas opciones incluyen: 1) análisis de sangre oculta en heces (FOBT) cada año, 2) sigmoidoscopia flexible cada cinco años, 3) FPBT anual más sigmoidoscopia flexible cada cinco años, 4) enema de bario de doble contraste (DCBE) cada cinco años o 5) colonoscopia cada diez años. A pesar de que estos procedimientos de prueba se aceptan bien por la comunidad médica, no se realiza la aplicación de la revisión generalizada para el cáncer colorrectal. La conformidad del paciente es un factor importante para el uso limitado debido a las molestias o inconvenientes que se asocian con los procedimientos. La prueba FOBT, aunque es un procedimiento no invasivo, requiere restricciones en la dieta y otras 3-5 días antes de la prueba. Los niveles de sensibilidad de esta prueba también son muy bajos para el adenocarcinoma colorrectal con una amplia variabilidad en función de la prueba. Las mediciones de sensibilidad para la detección de adenomas son aún menores ya que la mayoría de los adenomas no sangran. Por el contrario, la sensibilidad para los procedimientos más invasivos, tales como la sigmoidoscopia y colonoscopia es bastante alta debido a la visualización directa del lumen del colon. Ningún ensayo aleatorio evaluó la eficacia de estas técnicas, sin embargo, mediante la utilización de datos de estudios de casos y controles y de datos del Estudio Nacional de Pólipos (Estados Unidos) se demostró que la eliminación de los pólipos adenomatosos resulta en una reducción de 76-90% en la incidencia de CRC. La sigmoidoscopia tiene la limitación de sólo visualizar el lado izquierdo del colon dejando lesiones en el colon derecho sin ser detectados. Ambos procedimientos de alcance son caros, requieren una preparación catártica y tienen mayor riesgo de morbilidad y mortalidad. Pruebas mejoradas con mayor sensibilidad, especificidad, facilidad de uso y con disminución de los costos son claramente necesarias antes de la revisión más amplia general para el cáncer colorrectal se convierten en rutina.

La detección temprana del cáncer de color se basa generalmente en la prueba de sangre oculta en heces (FOBT) que se realiza anualmente en individuos asintomáticos. Las recomendaciones actuales que se adoptan por varias organizaciones de salud, lo que incluye a la Sociedad Americana del Cáncer, exigen la prueba de sangre oculta en heces a partir de los 50 años de edad, que se repite cada año hasta que el paciente ya no obtenga beneficio de la detección. Una FOBT positiva conduce a una examinación por colonoscopia del intestino; un procedimiento costoso e invasivo, con una tasa de complicaciones graves de una por cada 5,000 exámenes. Sólo el 12% de los pacientes con heces hemo positivas se

diagnostica con cáncer o pólipos en el momento de la colonoscopia. Varios estudios muestran que la detección por FOBT no mejora la mortalidad relacionada con el cáncer o la sobrevivencia general. La conformidad con la prueba de sangre oculta es pobre; menos del 20 por ciento de la población se ofrece o completa la FOBT como se recomienda. Si la FOBT se hace correctamente, el paciente recolecta una muestra fecal de tres deposiciones consecutivas. Las muestras se obtienen mientras el paciente se adhiere a directrices dietéticas y evita medicamentos que se conocen por inducir sangrado gastrointestinal oculto. En realidad, los médicos con frecuencia fallan en instruir a los pacientes adecuadamente, los pacientes con frecuencia no se adhieren al protocolo, y algunos pacientes encuentran la tarea de recoger las muestras fecales difícil o desagradable, por lo tanto, la conformidad con la prueba de sangre oculta anual es pobre. Si la comprobación de sensibilidad y especificidad se puede mejorar sobre métodos actuales, la frecuencia de las pruebas podría reducirse, la recolección de muestras consecutivas se eliminaría, las modificaciones de los horarios de medicación y de la dieta se eliminarían, y la conformidad del paciente se mejoraría. Para agravar el problema de la conformidad, la sensibilidad y especificidad de la FOBT para detectar el cáncer de colon es pobre. La pobre especificidad de la prueba conduce a la colonoscopia innecesaria, lo que añade un gasto considerable para la detección del cáncer de colon.

La especificidad de la FOBT se calculó del 96% en el mejor de los casos, con una sensibilidad del 43% (adenomas) y 50% (carcinoma colorrectal). La sensibilidad se puede mejorar mediante la utilización de una FOBT por inmunoensayo tal como la que se produce bajo el nombre 'InSure', con una sensibilidad mejorada del 77% (adenomas) y 88.9% (carcinoma colorrectal).

Marcadores moleculares de la enfermedad. Los marcadores moleculares de la enfermedad ofrecen varias ventajas sobre otros tipos de marcadores, una ventaja es que incluso muestras de tamaños muy pequeños y/o muestras cuyas arquitecturas de tejido no se mantienen pueden analizarse de forma eficiente. En la última década se demostró que un número de genes se expresan diferencialmente entre carcinomas de colon y normales. Sin embargo, ningún marcador único o en combinación demostró ser suficiente para el diagnóstico de los carcinomas... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para detectar y/o clasificar el carcinoma colorrectal en un sujeto que comprende determinar la presencia o ausencia de metilación CpG de FOXL2 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto en donde la hipermetilación CpG de FOXL2 es indicativa de la presencia o clase de dicho carcinoma colorrectal.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende poner en contacto el ADN genómico aislado de una muestra biológica que se obtuvo de dicho sujeto con al menos un reactivo, o serie de reactivos que distinguen entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos una región objetivo del ADN genómico, en donde la región objetivo comprende, o híbrida bajo condiciones rigurosas a una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de FOXL2 respectivamente, en donde dichos nucleótidos contiguos comprenden al menos una secuencia de dinucleótidos CpG, y en el cual se proporciona, al menos en parte, la detección y/o clasificación del carcinoma colorrectal.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

a) extraer o de cualquier otra forma aislar ADN genómico de una muestra biológica que se obtuvo del sujeto

b) tratar el ADN genómico de a), o un fragmento de este, con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina que no son metiladas en la posición 5 de esta a uracilo o a otra base que se detecta diferente a la citosina en términos de propiedades de hibridación;

c) poner en contacto el ADN genómico tratado, o el fragmento tratado del mismo con una enzima de amplificación y al menos un iniciador que comprende, una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos que es complementaria a, o híbrida en condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas a una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEO ID NO: 42, SEO ID NO: 43, y complementos de estas, en donde el ADN genómico tratado o el fragmento de este se amplifica para producir al menos un amplificado, o no se amplifica; y

d) determinar, basad en una presencia o ausencia de, o en una propiedad de dicho amplificado, el estado o nivel de metilación de al menos un dinucleótido CpG, de FOXL2, o un promedio, o un valor que refleja un estado o nivel de metilación promedio de una pluralidad de secuencias de dinucleótidos CpG of FOXL2, de manera que al menos se proporciona al menos en parte uno de detección y clasificación del carcinoma colorrectal.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde tratar el ADN genómico, o el fragmento de este en b), comprende usar un reactivo que se seleccione del grupo que comprende bisulfito, sulfito de hidrógeno, disulfito, y combinaciones de estos.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

a) extraer o de cualquier otra forma aislar ADN genómico de una muestra biológica que se obtiene del sujeto;

b) digerir el ADN genómico de a), o un fragmento del mismo, con una o más enzimas de restricción sensibles a la metilación;

c) poner en contacto la digestión con enzima de restricción de ADN de b), con una enzima de amplificación y al menos dos iniciadores adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido CpG de FOXL2 ; y

d) determinar, sobre la base de una presencia o ausencia de un amplificado el estado de metilación o el nivel de al menos un dinucleótido CpG de FOXL2, de manera que al menos uno de entre la detección y clasificación del carcinoma colorrectal, al menos en parte, se logre.

6. El uso de un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el diagnóstico y/o clasificación de carcinoma colorrectal.