Análisis de polarización por fluorescencia basado en péptidos para la detección de anticuerpos contra Mycobacterium bovis.

Procedimiento para detectar animales infectados con M. bovis, comprendiendo el procedimiento:



añadir un trazador a una muestra de un animal para formar una mezcla, en el que el trazador es un péptido de la proteína MPB70 de M. bovis conjugada con un fluoróforo y en el que el péptido está constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por la SEC. ID. nº 2 y SEC. ID. nº 6;

medir la polarización por fluorescencia de la mezcla; y

detectar la presencia de anticuerpos contra M. Bovis en el animal procedente de la polarización por fluorescencia medida de la mezcla.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2002/034964.

Solicitante: DIACHEMIX LLC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 223 NORTH WATER STREET, SUITE 500 MILWAUKEE, WI 53202 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: NASIR, MOHAMMAD, SARWAR, JOLLEY, MICHAEL, E., SURUJBALLI,Om P, ROMANOWSKA,Anna.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K39/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53).
  • A61K39/04 A61K […] › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Mycobacterium, p. ej. Mycobacterium tuberculosis.
  • A61K39/40 A61K 39/00 […] › bacterianos.
  • C07K14/35 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Mycobacteriaceae (F).
  • C12N1/12 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Algas unicelulares; Sus medios de cultivo (como novedades vegetales A01H 13/00).
  • G01N33/53 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
  • G01N33/531 G01N 33/00 […] › Producción de materiales de investigación o de análisis inmunoquímicos.
  • G01N33/533 G01N 33/00 […] › con un marcador fluorescente.
  • G01N33/542 G01N 33/00 […] › con inhibición estérica o modificación de la señal, p. ej. extinción de fluorescencia.
  • G01N33/566 G01N 33/00 […] › utilizando un soporte específico o proteínas receptoras como reactivos para la formación de uniones por ligando.
  • G01N33/569 G01N 33/00 […] › para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus.

PDF original: ES-2379774_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Análisis de polarización por fluorescencia basado en péptidos para la detección de anticuerpos contra Mycobacterium bovis

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de análisis para diagnóstico. Más específicamente, la presente invención se refiere a un análisis basado en péptidos que utiliza los cambios en la polarización por fluorescencia para detectar anticuerpos del suero contra Mycobacterium bovis.

Descripción de la técnica relacionada

La polarización por fluorescencia es una técnica muy conocida que se ha utilizado para numerosas aplicaciones, incluyendo diagnósticos de enfermedades, detección de patógenos transmitidos por los alimentos y la determinación de micotoxina en cereales. Véase M. S. Nasir, M. E. Jolley (1999) "Flourescence Polarization: An analytical tool for Immunoassay and Drug Discover y ." Combinatorial Chemistr y & High Throughput Screening, vol. 2, págs. 177-190. Los puntos fuertes globales de los análisis de polarización por fluorescencia consisten en la simplicidad, facilidad, rapidez y rentabilidad de los protocolos de los ensayos. Por ejemplo, los análisis de polarización por fluorescencia por lo general no requieren etapas de lavado.

En general, un análisis de polarización por fluorescencia para la detección de enfermedades se realiza de la manera siguiente. Se añade una pequeña cantidad de muestra en un tubo que contiene una solución tampón. Se lee un blanco en el instrumento. Se añade un trazador fluorescente específico para la enfermedad en el mismo tubo y se observa el valor de polarización resultante en segundos a minutos.

En la patente US nº 6.110.750, se dio a conocer una técnica de polarización por fluorescencia para la detección de animales infectados con Mycobacterium bovis. La técnica estaba basada en la proteína MPB70 segregada por M. bovis. La proteína MPB70 se consideró que era un antígeno inmunodominante específico de la especie que contiene por lo menos tres epítopos específicos de M. bovis independientes. La técnica de polarización por fluorescencia utilizó un trazador que contiene proteína MPB70 conjugada con un fluoróforo para detectar anticuerpos contra M. bovis en sueros de animales, tales como vacas, bisontes, llamas y alces. M. Lin et al. (1996) "Modification of the Mycobacterium bovis Extracellular Protein MPB70 with Fluorescein for Rapid Detection of Specific Serum and Antibodies by Fluorescence Polarization" Clin. Diagn. Lab. Immunol., vol. nº 4, págs. 438-443 da a conocer un trazador que comprende la proteína extracelular MPB70 de M. bovis conjugada con un fluoróforo y un procedimiento de detección de animales infectados con M. bovis utilizando este conjugado en un análisis de polarización por fluorescencia.

Sin embargo, para aumentar la sensibilidad potencial de los análisis de polarización por fluorescencia de M. bovis, es deseable desarrollar trazadores con fluorescencia a base de moléculas más pequeñas que MPB70.

Sumario de la invención

En un primer aspecto principal, la presente invención proporciona un análisis para la detección de animales infectados por M. bovis. Un trazador, que comprende un péptido de la proteína MPB70 de M. bovis conjugado con un fluoróforo, se añade a una muestra de suero de un animal para formar una mezcla. Se mide a continuación la polarización por fluorescencia de la mezcla. La presencia de anticuerpos de M. bovis en el animal se detecta a partir de la polarización por fluorescencia medida de la mezcla.

En un segundo aspecto principal, la presente invención proporciona un trazador para su utilización en un análisis de polarización por fluorescencia para anticuerpos específicos para M. bovis. El trazador comprende un péptido de la proteína MPB70 de M. bovis conjugado con un fluoróforo, de tal manera que el trazador puede unirse a anticuerpos específicos para M. bovis para producir un cambio detectable en la polarización por fluorescencia.

Descripción detallada de las formas de realización preferidas

En numerosos péptidos diferentes de MPB70 se identificó su idoneidad para detectar anticuerpos del suero contra M. bovis utilizando polarización por fluorescencia. En la presente memoria se describen los efectos específicos.

Ejemplo 1

Se preparó un péptido con la siguiente secuencia de aminoácidos: PTNAAFSKLPASTIDELKTN (Pro Thr Asn AIa Ala Phe Ser Lys Leu Pro Ala Ser Thr Ile Asp Glu Leu Lys Thr Asn) (Ref. nº 554. SEC. ID. nº 1) .

El péptido se marcó a continuación de la manera siguiente. Se disolvió el péptido (2 mg/ml) en bicarbonato sódico 1 M pH 8, 3 a temperatura ambiente. Se disolvió a continuación un colorante, éster succinimidílico de carboxifluoresceína (10 mg/ml) (5-FAM, SE, Molecular Probes, Oregon) en sulfóxido de dimetilo (SODM, Sigma-Aldrich Canada, Oakville, Ontario, Canadá) y se añadió una cantidad suficiente a la solución del péptido para dar una relación molar colorante:péptido de 1:1. Se agitó la mezcla durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Se añadió a la mezcla hidroxilamina tamponada a pH 8, 5 (Molecular Probes) y se continuó agitando durante 30 minutos más. A continuación se añadió la mezcla a una columna fina Sephadex G-25 (1x50 cm) , que se equilibró previamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS, fosfato sódico 0, 01 M + cloruro sódico al 0, 85%, pH 7, 2) enriquecida con azida sódica al 0, 02%. El péptido marcado se separó del colorante libre por elución con PBS. Se recogieron las fracciones (1 ml) y se hizo seguimiento de la absorbancia a 492 nm. El perfil de elución presentaba 2 picos bien separados, el primero de los cuales contenía el péptido marcado por fluorescencia. Las fracciones que contienen el primer pico se mezclaron a continuación y se concentraron utilizando una celda de ultrafiltración de Amicon (Millipore Corporation, Nepean, Ontario, Canadá) equipada con una membrana YM-1 de Amicon (Millipore) .

En este péptido marcado se analizó a continuación su idoneidad utilizada como trazador fluorescente para detectar anticuerpos del suero contra M. bovis. Específicamente, el péptido marcado se analizó añadiéndolo a muestras de suero de vacas, alces y ciervos, algunos de los cuales son positivos conocidos para la infección por M. bovis y algunos de los cuales son negativos conocidos para la infección por M. bovis. Se descubrió que los sueros positivos y negativos daban diferentes mediciones de polarización por fluorescencia después de añadir el péptido marcado. De este modo, se determinó que este péptido marcado puede utilizarse para detectar anticuerpos del suero contra M. bovis.

Ejemplo 2

Se preparó un péptido con la siguiente secuencia de aminoácidos: SVQGMSQDPVAVAASNNPEL (Ser Val Gln Gly Met Ser Gln Asp Pro Val Ala Val Ala Ala Ser Asn Asn Pro Glu Leu) (Ref. nº 555; SEC. ID. nº 2) .

Este péptido se marcó y purificó utilizando los procedimientos descritos en el ejemplo 1, excepto que se utilizó un colorante diferente, éster succinimidilico de fluoresceína-5-EX (Molecular Probes) , y la relación molar colorante:péptido fue 20:1. Este compuesto colorante tiene un grupo reactivo de succinimidilo que está separado del fluoróforo por un separador de siete átomos. Este separador minimiza la interacción entre el fluoróforo y los aminoácidos con los que el colorante está conjugado.

Este péptido marcado se analizó a continuación tal como se describió anteriormente en el ejemplo 1. Se descubrió que este péptido marcado puede utilizarse también para detectar anticuerpos del suero contra M. bovis, es decir, que los sueros positivo y negativo dieron diferentes mediciones de polarización por fluorescencia en la adición del péptido marcado.

Ejemplo 3

La proteína MPB70 era el epítopo explorado para preparar pequeños péptidos fluorescentes. La exploración del epítopo se realizó utilizando un bloque de síntesis de péptidos MultipinTM (DKP escindible, nº en catálogo KT-96-0-DKP, lote nº 1252-2A) constituido por 96 engranajes, que se adquirió en Mimotypes Pty Ltd., Calyton, Victoria, Australia. Se utilizó específicamente este kit, según las instrucciones de MultipinTM para sintetizar 96 péptidos de 15 aminoácidos cada uno, correspondiente cada uno a un péptido de MPB70. Después de la síntesis, cada péptido se acopló por enlace covalente con 6-carboxifluoresceína (isómero 2) . Los engranajes se lavaron a continuación... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento para detectar animales infectados con M. bovis, comprendiendo el procedimiento:

añadir un trazador a una muestra de un animal para formar una mezcla, en el que el trazador es un péptido de la proteína MPB70 de M. bovis conjugada con un fluoróforo y en el que el péptido está constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por la SEC. ID. nº 2 y SEC. ID. nº 6;

medir la polarización por fluorescencia de la mezcla; y detectar la presencia de anticuerpos contra M. Bovis en el animal procedente de la polarización por fluorescencia medida de la mezcla.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además: medir la polarización por fluorescencia de una referencia; y comparar la polarización por fluorescencia de la mezcla con la polarización por fluorescencia de la referencia.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la muestra es el suero.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el fluoróforo es la fluoresceína o un derivado de la misma.

5. Trazador para detectar anticuerpos contra M. bovis en el análisis de polarización por fluorescencia, en el que el trazador comprende un péptido de la proteína MPB70 de M. bovis conjugado con un fluoróforo, de tal manera que el trazador se une a anticuerpos específicos para M. bovis para producir un cambio detectable en la polarización por fluorescencia; en el que el péptido está constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por la SEC. ID. nº 2 y SEC. ID. nº 6.

6. Trazador según la reivindicación 5, en el que el péptido está constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº 2.

7. Trazador según la reivindicación 5, en el que el péptido está constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº 6.

8. Trazador según la reivindicación 7, en el que el fluoróforo es la 6-carboxifluoresceína.

9. Kit para la detección de anticuerpos contra M. bovis en una muestra extraída de un animal, en el que los anticuerpos se detectan utilizando polarización por fluorescencia y el kit comprende un trazador según la reivindicación 5.

 

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