ANÁLISIS DEL GENOMA CASI COMPLETO DE LA RESISTENCIA A FÁRMACOS DEL HCV.

Un análisis para identificar una mutación en el genoma de un HCV presente en una muestra,

comprendiendo el análisis las etapas sucesivas de: a) extracción del ARN viral procedente de la muestra que contiene el HCV; b) determinación del genotipo y el subtipo del HCV; c) síntesis de los ADNc parciales del genoma del HCV en tres reacciones de transcripción inversa separadas, la primera reacción de transcripción inversa se inicia a partir de un primer cebador antisentido externo seleccionado para hibridar específicamente con una secuencia de la UTR 3' de un genoma de HCV prototipo del mismo genotipo y subtipo, la segunda reacción de transcripción inversa se inicia a partir de un segundo cebador antisentido externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia de la región NS4B-NS5A del genoma del HCV prototipo y la tercera reacción de transcripción inversa se inicia a partir de un tercer cebador antisentido externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia de la región NS2 del genoma del HCV prototipo; d) síntesis de la segunda hebra y amplificación de los ADNc parciales de la etapa c) en tres reacciones de PCR separadas, comprendiendo la primera reacción de PCR una alícuota de la primera reacción de transcripción inversa, el primer cebador antisentido externo y un primer cebador efector externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia complementaria de la región NS4B-NS5A del genoma del HCV prototipo, comprendiendo la segunda reacción de PCR una alícuota de la segunda reacción de transcripción inversa, el segundo cebador antisentido externo y un segundo cebador efector externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia complementaria de la región NS2 del genoma del HCV prototipo, y comprendiendo la tercera reacción de PCR una alícuota de la tercera reacción de transcripción inversa, el tercer cebador antisentido externo y un tercer cebador efector externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia complementaria de la región UTR 5' del genoma del HCV prototipo, donde el segundo cebador antisentido externo hibrida con una secuencia de la región NS4B-NS5A del genoma del HCV prototipo que está localizada 3' con respecto a la región que es complementaria al primer cebador efector externo y donde el tercer cebador antisentido externo hibrida con una secuencia de la región NS2 del genoma del HCV prototipo que está localizada 3' con respecto a la región que es complementaria al segundo cebador efector externo; e) amplificación adicional de los ADNc parciales de la etapa d) en tres reacciones de PCR anidadas separadas, comprendiendo la primera reacción de PCR anidada una alícuota de la primera reacción de PCR y los primeros cebadores antisentido y efector internos, comprendiendo la segunda reacción de PCR anidada una alícuota de la segunda reacción de PCR y los segundos cebadores antisentido y efector internos, y comprendiendo la tercera reacción de PCR anidada una alícuota de la tercera reacción de PCR y los terceros cebadores antisentido y efector internos, donde los cebadores internos no se solapan con los cebadores externos, el segundo cebador antisentido interno hibrida con una secuencia de la región NS4B-NS5A del genoma del HCV prototipo que está localizada 3' con respecto a la región que es complementaria al primer cebador efector interno y el tercer cebador antisentido interno hibrida con una secuencia de la región NS2 del genoma del HCV prototipo que está localizada 3' con respecto a la región que es complementaria al segundo cebador efector interno; f) análisis de la secuencia de los ADNc adicionalmente amplificados de la etapa e); y g) comparación de las secuencias obtenidas a partir de la etapa f) con la del HCV prototipo

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IB2008/002924.

Solicitante: KATHOLIEKE UNIVERSITEIT LEUVEN
DEBIOPHARM S.A
.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: BELGICA.

Inventor/es: DUMONT,Jean-Maurice, VUAGNIAUX,Grégoire, SNOECK,Joke, VAN DOOREN,Sonia, VANDAMME,Anne-Mieke.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 31 de Octubre de 2008.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/70B6A

Clasificación PCT:

  • C12Q1/70 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen virus o bacteriófagos.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2361598_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Antecedentes de la Invención

Campo de la Invención

La presente invención hace referencia a análisis que detectan y caracterizan mutaciones individuales o ligadas en un genoma de un Virus de la Hepatitis C (HCV) que están asociadas con la resistencia de un sujeto a un fármaco anti-HCV. Los análisis también se pueden utilizar para pronosticar la resistencia a un fármaco anti-HCV de un sujeto infectado con HCV antes de o al principio de la terapia antiviral o para seleccionar una terapia alternativa para un sujeto infectado por HCV que ha desarrollado resistencia a un fármaco o combinación de fármacos terapéuticos concretos. La invención también hace referencia a pares de cebadores nucleotídicos y kits para llevar a cabo estos análisis.

Descripción de la Técnica Relacionada

El HCV fue clonado y caracterizado hace aproximadamente 15 años por Choo y colaboradores. Choo et al. (1989) Science 244, 359-362. El HCV pertenece a la familia Flaviviridae y comprende una nucleocápside con envoltura y un genoma con ARN de hebra sencilla de polaridad positiva. (Bartenschlager et al. (2003) Antiviral Res 60, 91 - 102). El genoma del HCV consiste en regiones 5' y 3' no codificantes (UTR o NCR) que flanquean un único marco de lectura abierto (ORF) largo. Este ORF codifica tres proteínas estructurales en el extremo amino terminal y seis proteínas no estructurales (NS) en el extremo carboxi terminal. Las proteínas estructurales son la proteína núcleo de la nucleocápside (C) y las dos glicoproteínas de la envoltura 1 (E1) y la envoltura 2 (E2). Las proteínas no estructurales se denominan NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b. La NCR 5' es la región más altamente conservada del genoma del HCV, mientras las secuencias de las dos proteínas de la envoltura (E1 y E2) son muy variables entre los diferentes productos aislados del HCV. El grado de variación más elevado se ha observado en una región dentro de E2, conocida ahora comúnmente como región hipervariable 1.

Desde la identificación inicial del HCV, se han identificado al menos 7 tipos virales principales diferentes y se han denominado genotipos 1 a 7. En estos genotipos existen numerosos subtipos (p. ej. HCV1a, 1b, 1c). El genotipo y el subtipo de un virus con el cual se infecta un sujeto puede afectar a la prognosis clínica así como a la sensibilidad a diferentes tratamientos con fármacos. (Simmonds et al. (1995) Hepatology 21, 570-582; Bukh et al. (1995) Semin Liver Dis 15, 41-63; Chevaliez y Pawlotsky (2007) World J Gastroenterol 13, 2461-2466).

La infección por HCV sigue siendo hasta la fecha un grave problema médico. En la actualidad existen aproximadamente 170 millones de personas infectadas por el HCV. El HCV es transmitido principalmente a través de la sangre y los productos sanguíneos así como por la transmisión vertical durante el embarazo. El transcurso inicial de la infección es típicamente suave. No obstante, el sistema inmunitario es a menudo incapaz de aclarar el virus, y los sujetos con una infección persistente se encuentran en un riesgo elevado de cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular. (Poynard et al. (1997) Lancet 349, 825-832).

El tratamiento convencional actual para la infección crónica por HCV se basa en una combinación de interferón alfa pegilado y ribavirina. Esta terapia produce una respuesta anti-viral sostenida en el 85-90% de los sujetos infectados con los genotipos 2 y 3, pero, desafortunadamente, solamente en aproximadamente el 45% de los sujetos infectados con el genotipo 1 prevalente. (Stribling et al. (2006) Gastroenterol Clin North Am vol, 463-486.) Se requieren terapias adicionales que utilicen otros fármacos y combinaciones de fármacos que estén dotadas de una actividad antiviral más elevada y de perfiles de seguridad superiores, en particular para la prevención de la recurrencia del HCV.

La introducción de ensayos de diagnóstico para escrutar productos sanguíneos ha reducido de manera significativa la tasa de nuevas infecciones. La disponibilidad de modelos in vitro, esto es, modelos de replicones subgenómicos de HCV y de un modelo de cultivo de células infecciosas, y las mejoras en las técnicas de investigación molecular tales como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) han facilitado el desarrollo de inhibidores potentes adicionales de la replicación del HCV que se dirigen directamente a una proteína viral o que actúan indirectamente a través de las proteínas del anfitrión implicadas en la infección viral. (Bartenschlager (2002) Nat Rev Drug Discov 1, 911- 916; Wakita et al. (2005) Nat Med 11, 791-796.) Varios de estos nuevos compuestos se han presentado a pruebas clínicas o ya están en el mercado (http://www.hcvadvocate.org/ hepatitis/hepC/HCVDrugs_2007.pdf).

Se han desarrollado análisis que tienen como objetivo proporcionar información prognóstica sobre la posibilidad de sensibilización a una terapia anti-HCV. (Gretch et al. (1997) Hepatology 26, 43s-47s; Podzorski (2002) Arch Pathol Lab Med 126, 285-290). Estos análisis incluyen ensayos serológicos y ensayos moleculares cualitativos o cuantitativos. Los ejemplos de los análisis basados en la PCR de la carga viral de HCV son Cobas Amplicor® (Roche) y m2000 Real-Time PCR Diagnostics System® (Abott). Otros análisis basados en la PCR que incluyen, p.

ej., Versant® HCV Genotyping Assay (Bayer Diagnostics), INNO-LiPA HCV II® (Innogenetics), kit de DEIA GEN-ETIK (Sorin, Saluggia, Italia) y kit de genotipaje TRUGENE HCV 5'NC (Visible Genetics Europe, Evry, Francia) identifican el genotipo y el subtipo del HCV. Un método adicional por medio del cual se detectan mutaciones es el de Yagi et al., Journal of Medical Virology 77, páginas 399 – 413 de 2005, que detalla los genomas de HCV tomados de biopsias de hígado, que son clonados con posterioridad mediante transcripción inversa de larga distancia RT-PCR, seguido de 3 reacciones de PCR en las cuales en una PCR de larga distancia primaria se amplifica el genoma completo, después de lo cual tiene lugar una PCR secundaria anidada, y una terciaria; se analiza la secuencia del ADNc amplificado y se determinan las mutaciones, véase la Fig. 1A. Recientemente se ha recomendado la evaluación sistemática del genotipo y el subtipo de HCV antes de la terapia debido a que el genotipo de HCV determinará la elección y el régimen de dosificación del fármaco anti-HCV más eficaz, p. ej. ribavirina o interferón, así como la duración del tratamiento. La identificación actual del genotipo depende principalmente de la secuenciación de una pequeña subregión de un genoma del HCV, p. ej., la UTR 5', pero no del genoma completo o casi completo del HCV.

Compendio de la Invención

En su realización más general, la presente invención hace referencia a un análisis para identificar una mutación en el genoma del HCV presente en una muestra. El análisis comprende las siguientes etapas que se llevan a cabo de manera sucesiva:

a) extracción del ARN viral de la muestra que contiene el HCV;

b) determinación del genotipo y subtipo del HCV;

c) síntesis de los ADNc parciales del genoma del HCV en tres reacciones de transcripción inversa separadas, la primera reacción de transcripción inversa se inicia a partir de un primer cebador antisentido externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia en la UTR 3' de un genoma de HCV prototipo del mismo genotipo y subtipo, la segunda reacción de transcripción inversa se inicia a partir de un segundo cebador antisentido externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia de la región NS4B-NS5A del genoma del HCV prototipo y la tercera reacción de transcripción inversa se inicia a partir de un tercer cebador antisentido externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia de la región NS2 del genoma del HCV prototipo;

d) síntesis de la segunda hebra y amplificación de los ADNc parciales de la etapa c) en tres reacciones de PCR separadas, comprendiendo la primera reacción de PCR una alícuota de la primera reacción de transcripción inversa, el primer cebador antisentido externo y un primer cebador efector externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia complementaria de la región NS4B-NS5A del genoma del HCV prototipo, comprendiendo la segunda reacción de PCR una alícuota de la segunda reacción de transcripción inversa, el segundo cebador antisentido externo y un segundo cebador efector externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia complementaria de la región NS2 del genoma del HCV prototipo, y comprendiendo... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un análisis para identificar una mutación en el genoma de un HCV presente en una muestra, comprendiendo el análisis las etapas sucesivas de:

a) extracción del ARN viral procedente de la muestra que contiene el HCV;

b) determinación del genotipo y el subtipo del HCV;

c) síntesis de los ADNc parciales del genoma del HCV en tres reacciones de transcripción inversa separadas, la primera reacción de transcripción inversa se inicia a partir de un primer cebador antisentido externo seleccionado para hibridar específicamente con una secuencia de la UTR 3' de un genoma de HCV prototipo del mismo genotipo y subtipo, la segunda reacción de transcripción inversa se inicia a partir de un segundo cebador antisentido externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia de la región NS4B-NS5A del genoma del HCV prototipo y la tercera reacción de transcripción inversa se inicia a partir de un tercer cebador antisentido externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia de la región NS2 del genoma del HCV prototipo;

d) síntesis de la segunda hebra y amplificación de los ADNc parciales de la etapa c) en tres reacciones de PCR separadas, comprendiendo la primera reacción de PCR una alícuota de la primera reacción de transcripción inversa, el primer cebador antisentido externo y un primer cebador efector externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia complementaria de la región NS4B-NS5A del genoma del HCV prototipo, comprendiendo la segunda reacción de PCR una alícuota de la segunda reacción de transcripción inversa, el segundo cebador antisentido externo y un segundo cebador efector externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia complementaria de la región NS2 del genoma del HCV prototipo, y comprendiendo la tercera reacción de PCR una alícuota de la tercera reacción de transcripción inversa, el tercer cebador antisentido externo y un tercer cebador efector externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia complementaria de la región UTR 5' del genoma del HCV prototipo, donde el segundo cebador antisentido externo hibrida con una secuencia de la región NS4B-NS5A del genoma del HCV prototipo que está localizada 3' con respecto a la región que es complementaria al primer cebador efector externo y donde el tercer cebador antisentido externo hibrida con una secuencia de la región NS2 del genoma del HCV prototipo que está localizada 3' con respecto a la región que es complementaria al segundo cebador efector externo;

e) amplificación adicional de los ADNc parciales de la etapa d) en tres reacciones de PCR anidadas separadas, comprendiendo la primera reacción de PCR anidada una alícuota de la primera reacción de PCR y los primeros cebadores antisentido y efector internos, comprendiendo la segunda reacción de PCR anidada una alícuota de la segunda reacción de PCR y los segundos cebadores antisentido y efector internos, y comprendiendo la tercera reacción de PCR anidada una alícuota de la tercera reacción de PCR y los terceros cebadores antisentido y efector internos, donde los cebadores internos no se solapan con los cebadores externos, el segundo cebador antisentido interno hibrida con una secuencia de la región NS4B-NS5A del genoma del HCV prototipo que está localizada 3' con respecto a la región que es complementaria al primer cebador efector interno y el tercer cebador antisentido interno hibrida con una secuencia de la región NS2 del genoma del HCV prototipo que está localizada 3' con respecto a la región que es complementaria al segundo cebador efector interno;

f) análisis de la secuencia de los ADNc adicionalmente amplificados de la etapa e); y g) comparación de las secuencias obtenidas a partir de la etapa f) con la del HCV prototipo.

2. Un análisis capaz de identificar y caracterizar mutaciones individuales y ligadas en un genoma de una variante de HCV resistente a un fármaco anti-HCV, comprendiendo el análisis las etapas sucesivas de:

a) extracción del ARN viral a partir de una muestra tomada de un sujeto que porta un HCV que es resistente a un fármaco o un fármaco o combinación de fármacos anti-HCV con los cuales se ha tratado el sujeto como indica el fracaso del tratamiento;

b) determinación del genotipo y el subtipo del HCV;

c) síntesis de los ADNc parciales del genoma del HCV en tres reacciones de transcripción inversa separadas, la primera reacción de transcripción inversa se inicia a partir un primer cebador antisentido externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia de la UTR 3' de un genoma de HCV prototipo del mismo genotipo y subtipo, la segunda reacción de transcripción inversa se inicia a partir de un segundo cebador antisentido externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia de la región NS4B-NS5A del genoma del HCV prototipo y la tercera reacción de transcripción inversa se inicia a partir de un tercer cebador antisentido externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia de la región NS2del genoma de HCV prototipo;

d) síntesis de la segunda hebra y amplificación de los ADNc parciales de la etapa c) en tres reacciones de PCR separadas, comprendiendo la primera reacción de PCR una alícuota de la primera reacción de transcripción inversa, el primer cebador antisentido externo y un primer cebador efector externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia complementaria de la región NS4B-NS5A del genoma del HCV prototipo, comprendiendo la segunda reacción de PCR una alícuota de la segunda reacción de transcripción inversa, el segundo cebador antisentido externo y un segundo cebador efector externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia complementaria en la región NS2 del genoma del HCV prototipo, y comprendiendo la tercera reacción de PCR una alícuota de la tercera reacción de transcripción inversa, el tercer cebador antisentido externo y un tercer cebador efector externo seleccionado para que hibride específicamente con una secuencia complementaria de la región UTR 5' del genoma del HCV prototipo, donde el segundo cebador antisentido externo hibrida con una secuencia de la región NS4B-NS5A del genoma del HCV prototipo que está localizada 3' con respecto a la región que es complementaria al primer cebador efector externo y donde el tercer cebador antisentido externo hibrida con una secuencia de la región NS2 del genoma del HCV prototipo que está localizada 3' con respecto a la región que es complementaria al segundo cebador efector externo;

e) amplificación adicional de los ADNc parciales de la etapa d) en tres reacciones de PCR anidadas separadas, comprendiendo la primera reacción de PCR anidada una alícuota de la primera reacción de PCR y los primeros cebadores antisentido y efector internos, comprendiendo la segunda reacción de PCR anidada una alícuota de la segunda reacción de PCR y los segundos cebadores antisentido y efector internos, y comprendiendo la tercera reacción de PCR anidada una alícuota de la tercera reacción de PCR y los terceros cebadores antisentido y efector internos, donde los cebadores internos no se solapan con los cebadores externos, el segundo cebador antisentido interno hibrida con una secuencia de la región NS4B-NS5A del genoma del HCV prototipo que está localizada 3' con respecto a la región que es complementaria al primer cebador efector interno y el tercer cebador antisentido interno hibrida con una secuencia de la rfegión NS2 del genoma del HCV prototipo que está localizada 3' con respecto a la región que es complementaria al segundo cebador efector interno;

f) análisis de la secuencia de los ADNc adicionalmente amplificados de la etapa e);

g) comparación de las secuencias obtenidas a partir de la etapa f) con la del HCV prototipo e identificación de mutaciones; y

h) introducción de las mutaciones identificadas en un banco de datos de mutaciones de HCV asociadas con la resistencia a fármacos anti-HCV.

3. El análisis de la reivindicación 2, donde la etapa h) consiste en una búsqueda en el banco de datos de las mutaciones de HCV asociadas con la resistencia a fármacos anti-HCV de las mutaciones identificadas y una selección del tratamiento subsiguiente del sujeto con un fármaco o combinación de fármacos anti-HCV a los cuales no se espera que sea resistente el HCV.

4. El análisis de la reivindicación 3, donde la muestra se toma de un sujeto infectado con HCV antes del comienzo de cualquier terapia farmacológica del sujeto.

5. El análisis de la reivindicación 5, que comprende las etapas sucesivas de:

a) extracción del ARN viral a partir de la muestra que contiene el HCV;

b) determinación del genotipo y el subtipo del HCV;

c) siempre que la etapa b) indique que el HCV es de tipo 1b, síntesis de los ADNc parciales del genoma del HCV en tres reacciones de transcripción inversa separadas, la primera reacción de transcripción inversa se inicia a partir de un cebador poli-A, la segunda reacción de transcripción inversa se inicia a partir de un cebador HCV1bOR6312 (SEQ ID: 2) y la tercera reacción de transcripción inversa se inicia a partir del cebador HCV1bOR3306 (SEQ ID: 3);

d) síntesis de la segunda hebra y amplificación de los ADNc parciales de la etapa c) en tres reacciones de PCR separadas, comprendiendo la primera reacción de PCR una alícuota de la primera reacción de transcripción inversa y el par de cebadores poli-A/HCV1bOF6074 (SEQ IDS: 1 y 4), comprendiendo la segunda reacción de PCR una alícuota de la segunda reacción de transcripción inversa y el par de cebadores HCV1bOR6312 (SEQ ID: 2)/HCV1bOF1977 (SEQ ID: 5) y comprendiendo la tercera reacción de PCR una alícuota de la tercera reacción de transcripción inversa y el par de cebadores HCV1bOR3306/HCVOF129 (SEQ ID: 6);

e) amplificación adicional de los ADNc parciales de la etapa d) en tres reacciones de PCR anidadas separadas, comprendiendo la primera reacción de PCR anidada una alícuota de la primera reacción de PCR y el par de cebadores HCV1blR9339 (SEQ ID: 7)/HCV1blF6126 (SEQ ID: 10), comprendiendo la segunda reacción de PCR anidada una alícuota de la segunda reacción de PCR y el par de cebadores HCV1blR6282 (SEQ ID: 8)/HCV1blF2523 (SEQ ID: 11), y comprendiendo la tercera reacción de PCR anidada una alícuota de la tercera reacción de PCR y el par de cebadores HCV1 blR2770 (SEQ ID): 9)/HCVIF278 (SEQ ID: 12);

f) análisis de la secuencia de los ADNc adicionalmente amplificados de la etapa e); y

g) comparación de las secuencias obtenidas a partir de la etapa f) con la de un HCV1b prototipo.

6. El análisis de la reivindicación 2, que comprende las etapas sucesivas de:

a) extracción del ARN viral procedente de una muestra tomada de un sujeto que alberga un HCV que es resistente a un fármaco o combinación de fármacos anti-HCV con el cual se ha tratado al sujeto;

b) determinación del genotipo y el subtipo del HCV;

c) siempre que la etapa b) indique que el HCV es de tipo 1b, síntesis de los ADNc parciales del genoma del HCV en tres reacciones de transcripción inversa separadas, la primera reacción de transcripción inversa se inicia a partir de un cebador poli-A, la segunda reacción de transcripción inversa se inicia a partir del cebador HCV1bOR6312 y la tercera reacción de transcripción inversa se inicia a partir del cebador HCV1bOR3306;

d) síntesis de la segunda hebra y amplificación de los ADNc parciales de la etapa c) en tres reacciones de PCR separadas, comprendiendo la primera reacción de PCR una alícuota de la primera reacción de transcripción inversa y el par de cebadores poli-A/HCV1bOF6074, comprendiendo la segunda reacción de PCR una alícuota de la segunda reacción de transcripción inversa y el par de cebadores HCV1bOR6312/HCV1bOF1977 y comprendiendo la tercera reacción de PCR una alícuota de la tercera reacción de transcripción inversa y el par de cebadores HCV1bOR3306/HCVOF129;

e) amplificación adicional de los ADNc parciales de la etapa d) en tres reacciones de PCR anidadas separadas, comprendiendo la primera reacción de PCR anidada una alícuota de la primera reacción de PCR y el par de cebadores HCV1blR9339/HCV1blF6126, comprendiendo la segunda reacción de PCR anidada una alícuota de la segunda reacción de PCR y el par de cebadores HCV1blR6282/HCV1blF2523, y comprendiendo la tercera reacción de PCR anidada una alícuota de la tercera reacción de PCR y el par de cebadores HCV1blR2770/HCVIF278;

f) análisis de la secuencia de los ADNc adicionalmente amplificados de la etapa e);

g) comparación de las secuencias obtenidas a partir de la etapa f) con la del HCV 1b prototipo e identificación de las mutaciones; y

h) introducción de las mutaciones identificadas en un banco de datos de mutaciones de HCV asociadas con la resistencia a un fármaco anti-HCV.

7. El análisis de la reivindicación 6, donde la etapa h) consiste en una búsqueda en un banco de datos de mutaciones de HCV asociadas con la resistencia a un fármaco anti-HCV de las mutaciones identificadas y selección del tratamiento subsiguiente del sujeto con un fármaco o una combinación de fármacos anti-HCV a los cuales no se espera que sea resistente el HCV.

8. El análisis de la reivindicación 7, donde la muestra se toma de un sujeto infectado con HCV antes del comienzo de cualquier terapia farmacológica del sujeto.

9. Un par de cebadores que consiste en poli-A y HCV1bOF6074.

10. Un par de cebadores que consiste en HCV1bOR6312 y HCV1bOF1977.

11. Un par de cebadores que consiste en HCV1bOR3306 y HCVOF129.

12. Un par de cebadores que consiste en HCV1blR9339 y HCV1blF6126.

13. Un par de cebadores que consiste en HCV1blR6282 y HCV1blF2523.

14. Un par de cebadores que consiste en HCV1blR2770 y HCVIF278.

15. Un kit para la detección de mutaciones en un genoma de HCV, donde dicho kit comprende un par de cebadores de cualquiera de las reivindicaciones 9-14.

16. Un kit para la detección de mutaciones en un genoma de HCV, donde dicho kit comprende los pares de cebadores de las reivindicaciones 9-14.

 

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