Amplificación de ácidos nucleicos en presencia de oligómeros aleatorios modificados.

Composición que comprende:

- una ADN polimerasa termoestable,

- desoxinucleótidos,

- un oligonucleótido 5-8-mero aleatorizado, caracterizado porque dicho oligonucleótido comprende una modificacióncon una fracción orgánica hidrofóbica,

en el extremo 5' de dicho oligonucleótido aleatorizado, en la que dicha fracción es un pireno o un estilbeno, y

- unapareja de cebadores de amplificación.

Amplificación de ácidos nucleicos en presencia de oligómeros aleatorios modificados La presente invención se refiere al campo de las reacciones de extensión de cebador catalizadas por polimerasa dependiente molde. En particular, la invención proporciona un nuevo método para la amplificación de ácidos nucleicos mediante la realización de una reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Más concretamente, la presente invención proporciona un nuevo método para llevar a cabo una PCR de inicio en caliente en el aspecto de que se evita la amplificación de dímeros cebadores no específicos.

Antecedentes de la técnica Un problema importante de la amplificación de ácidos nucleicos y más especialmente de la PCR es la generación de productos de amplificación no específicos. En muchos casos esto se debe a un cebado con oligonucleótidos no específicos y el suceso posterior de extensión del cebador antes del procedimiento de termociclado mismo, ya que las ADN polimerasas termoestables también son moderadamente activas a temperatura ambiente. Por ejemplo, los productos de amplificación debidos a la dimerización aleatoria de cebadores y su posterior extensión se observan con frecuencia. Con el fin de superar este problema, es bien conocido de la técnica llevar a cabo una PCR denominada "de inicio en caliente", en la que un componente esencial para la reacción de amplificación se separa de la mezcla de reacción o se mantiene en un estado inactivo hasta incrementar la temperatura de la mezcla de reacción por primera vez. Debido a que la polimerasa no puede funcionar bajo estas condiciones, no se produce alargamiento del cebador durante el periodo en que los cebadores pueden unirse de manera no específica. Para conseguir este efecto se han utilizado varios métodos:

a) la separación física de la ADN polimerasa.

La separación física puede obtenerse mediante, por ejemplo, una barrera de cera sólida, que separa el compartimiento que contiene la ADN polimerasa del compartimiento que contiene la masa principal de los demás reactivos. Durante la primera etapa de calentamiento la cera se funde automáticamente y se mezclan los compartimientos líquidos (Chou Q. et al., Nucleic Acids Res. 20:1717-23, 1992; patente US nº 5.411.876) . Alternativamente, la ADN polimerasa se inmoviliza por afinidad sobre un soporte sólido antes de la reacción de amplificación y sólo se libera a la mezcla de reacción mediante una liberación mediada por calor (Nilsson J. et al., Biotechniques 22:744-51, 1997) . Sin embargo, ambos métodos resultan laboriosos y de realización incómoda.

b) Modificación química de la ADN polimerasa

Para este tipo de PCR de inicio en caliente, la ADN polimerasa se inactiva reversiblemente como resultado de una modificación química. Más concretamente, se introducen grupos de bloqueo termolábiles en la ADN polimerasa Taq, que dejan inactivo el enzima a temperatura ambiente (patente US nº 5.773.258) . Estos grupos de bloqueo se eliminan a temperatura elevada durante una etapa previa a la PCR, de manera que el enzima se activa. Dicha modificación termolábil puede obtenerse, por ejemplo, mediante acoplamiento de anhídrido citracónico o anhídrido aconítrico con los residuos de lisina del enzima (patente US nº 5.677.152) . Los enzimas que portan dichas modificaciones se encuentran disponibles comercialmente, como Amplitaq Gold (Moretti T. et al., Biotechniques 25:716-22, 1998) o la ADN polimerasa FastStart (Roche Molecular Biochemicals) . Sin embargo, la introducción de grupos de bloqueo es una reacción química que se produce arbitrariamente en todos los residuos de lisina estéricamente disponibles del enzima. Por lo tanto, la reproducibilidad y calidad de las preparaciones enzimáticas modificadas químicamente puede variar y resulta difícil de controlar.

b) Modificación por recombinación de la ADN polimerasa Se preparan mutantes sensibles al frío de la polimerasa Taq mediante ingeniería genética. Estos mutantes difieren del enzima de tipo salvaje en que no presentan el extremo N-terminal (patente US nº 6.241.557) . En contraste con la polimerasa Taq recombinante nativa o de tipo salvaje, estos mutantes son completamente inactivos a una temperatura inferior a 35ºC y, de esta manera, pueden utilizarse en algunos casos para llevar a cabo una PCR de inicio en caliente. Sin embargo, la forma mutante sensible al frío con extremo N-terminal truncado requiere condiciones de tampón de baja concentración salina, presenta una procesividad inferior comparado con el enzima de tipo salvaje y, de esta manera, sólo puede utilizarse para la amplificación de ácidos nucleicos diana cortos. Además, debido a que la forma truncada no presenta actividad de exonucleasa 5'-3', no puede utilizarse para experimentos de PCR en tiempo real basados en el formato de detección TaqMan. d) Inhibición de la ADN polimerasa por la adición de ácidos nucleicos Se ha demostrado que la extensión de cebadores apareados no específicamente resulta inhibida por la inhibición de fragmentos cortos de ADN de doble cadena (Kainz P. et al., Biotechniques 28:278-82, 2000) . En este caso, la

extensión del cebador resulta inhibida a temperaturas inferiores al punto de fusión del fragmento corto de ADN de doble cadena, pero es independiente de la secuencia del ADN competidor mismo. Sin embargo, se desconoce en qué grado el exceso de ADN competidor influye sobre el rendimiento de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos.

Alternativamente, pueden utilizarse oligonucleótidos aptámeros con una secuencia específica que resulte en una estructura secundaria definida. Dichos aptámeros han sido seleccionados utilizando la tecnología SELEX para una afinidad muy elevada para la ADN polimerasa (patente US nº 5.693.502; Lin Y. y Jayasena S.D., J. Mol. Biol. 271:100-11, 1997) . La presencia de dichos aptámeros en la mezcla de amplificación antes del procedimiento de termociclado mismo nuevamente resulta en una afinidad de unión elevada para la ADN polimerasa y en consecuencia en una inhibición termolábil de la actividad de la misma (patente US nº 6.020.130) . Sin embargo, debido al procedimiento de selección, todos los aptámeros disponibles hasta el momento sólo pueden utilizarse en combinación con una especie particular de ADN polimerasa.

e) Anticuerpos de ADN Taq

Un enfoque alternativo para conseguir la inhibición termolábil de la ADN polimerasa Taq es la adición de anticuerpos monoclonales generados contra el enzima purificado (Kellogg D.E. et al., Biotechniques 16:1134-7, 1994; Sharkey

D.J. et al., Biotechnology (NY) 12:506-9, 1994) . Al igual que los oligonucleótidos aptámeros, el anticuerpo se une a la ADN polimerasa Taq con afinidad elevada a temperatura ambiente de manera inhibidora (patente US nº 5.338.671) . Se resuelve el complejo en una etapa de precalentamiento previa al procedimiento de termociclado mismo. Lo anterior conduce a una prolongación sustancial del tiempo de amplificación globalmente, especialmente en el caso de que se apliquen protocolos para el termociclado rápido (documento WO nº 97/46706) .

La patente US nº 5.985.619 da a conocer una realización específica para llevar a cabo una PCR utilizando un anticuerpo de inicio en caliente, en la que aparte de la polimerasa Taq, se añade por ejemplo exonucleasa III de E. coli en forma de suplemento a la mezcla de amplificación con el fin de digerir los intermediarios dímeros de cebador no específicos. Tal como se ha dado a conocer anteriormente, la exonucleasa III reconoce el ADN de doble cadena como sustrato, tal como, por ejemplo, híbridos de diana/cebador o de diana/producto de extensión de cebador. La digestión tiene lugar mediante el corte del enlace fosfodiéster en el extremo 5' del residuo desoxinucleótido 3'terminal. Debido a que este tipo de exonucleasa se encuentra activo a temperatura ambiente, todos los cebadores y productos de extensión de cebador apareados no específicamente resultan digeridos. Ello resulta, en algunas realizaciones, en una especificidad incrementada uniforme de la reacción de amplificación. Sin embargo, la digestión de los cebadores no específicos dependiente de la duración del tiempo de preincubación puede conducir a una reducción sustancial y no controlada de la concentración de cebador, que a su vez podría afectar a la reacción de amplificación misma.

f) Uso de cebadores modificados solos o en combinación con exonucleasas

Las patentes EP nº 0 799 888 y GB nº 2293238 dan a conocer una adición de oligonucleótidos 3'-bloqueados a las reacciones de PCR. Debido al bloqueo de 3', estos oligonucleótidos no pueden actuar como cebadores. Los oligonucleótidos bloqueados están diseñados para competir/interactuar con los cebadores de PCR, lo que... [Seguir leyendo]

1. Composición que comprende:

- una ADN polimerasa termoestable,

- desoxinucleótidos,

- un oligonucleótido 5-8-mero aleatorizado, caracterizado porque dicho oligonucleótido comprende una modificación con una fracción orgánica hidrofóbica, en el extremo 5' de dicho oligonucleótido aleatorizado, en la que dicha fracción es un pireno o un estilbeno, y - una

pareja de cebadores de amplificación.

2. Composición según la reivindicación 1, que comprende además una muestra de ácido nucleico diana.

3. Kit que comprende:

- una ADN polimerasa termoestable, y

- un oligonucleótido 5-8-mero aleatorizado, caracterizado porque dicho oligonucleótido comprende una modificación con pireno o un estilbeno en el extremo 5'.

.Kit según la reivindicación 3, que comprende además una pareja de cebadores de amplificación.

5. Método para la amplificación por PCR de un ácido nucleico diana específico, que comprende las etapas de:

- proporcionar una muestra que se sospecha que contiene dicho ácido nucleico diana.

25. añadir una composición según la reivindicación 1, y

- llevar a cabo una reacción de amplificación por PCR.

6. Método según la reivindicación 5, caracterizado porque dicha reacción de amplificación de ácidos nucleicos es una reacción en cadena de la polimerasa de la cual se realiza un seguimiento en tiempo real.

7. Método según las reivindicaciones 5 y 6, caracterizado porque el producto de amplificación generado en dicha amplificación se somete a un análisis de curva de fusión.