Amplificación de ácido nucleico con emulsión de flujo continuo.

Método para amplificar material genético que comprende:

(i) emulsionar un fluido acuoso que comprende una mezcla de reacción de PCR y una pluralidad de perlassuspendidas en un flujo continuo de aceite para crear una pluralidad de microrreactores acuososencapsulados en un flujo continuo de aceite,

en el que una pluralidad de los microrreactores incluyen cada uno una o más especies de molde de ácidonucleico y una perla individual que puede capturar un molde de ácido nucleico y reactivos suficientes paraamplificar el número de copias de una o más especies del molde de ácido nucleico,

y en el que emulsionar comprende bombear un aceite de emulsión y el fluido que comprende la mezcla dereacción de PCR y las perlas suspendidas en un emulsificador de flujo cruzado que comprende uno o máselementos en T de inyección

(mezclado) y un dispositivo vibratorio antiobstrucción para evitar que las perlasobstruyan una boquilla del uno o más elementos en T de inyección; y

(ii) procesar térmicamente la emulsión que comprende la pluralidad de microrreactores acuosos haciéndolafluir a través de zonas estacionarias de temperatura controlada para amplificar la una o más especies demolde de ácido nucleico mediante reacción en cadena de la polimerasa, en el que la perla individualcaptura las copias amplificadas de la una o más especies de molde de ácido nucleico; y

(iii) romper la emulsión para recuperar las perlas y los moldes de ácido nucleico amplificados capturados

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2005/003488.

Solicitante: 454 LIFE SCIENCES CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 20 COMMERCIAL STREET BRANFORD CT 06405 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: .

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION B — TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES > PROCEDIMIENTOS O APARATOS FISICOS O QUIMICOS EN GENERAL > MEZCLA, p. ej. DISOLUCION, EMULSION, DISPERSION (mezcla... > Mezcladores de flujo (pulverizadores, atomizadores... > B01F5/04 (Mezcladores de inyectores)
  • SECCION B — TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES > PROCEDIMIENTOS O APARATOS FISICOS O QUIMICOS EN GENERAL > APARATOS DE LABORATORIO PARA LA QUIMICA O LA FISICA,... > B01L3/00 (Recipientes o utensilios para laboratorios, p. ej. cristalería de laboratorio (botellas B65D; equipos para enzimología o microbiología C12M 1/00 ); Cuentagotas (recipientes para volumetría G01F))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos que contienen radicales... > C12P19/34 (Polinucleótidos, p. ej. ácidos nucleicos, oligorribonucleótidos)
  • SECCION B — TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES > PROCEDIMIENTOS O APARATOS FISICOS O QUIMICOS EN GENERAL > MEZCLA, p. ej. DISOLUCION, EMULSION, DISPERSION (mezcla... > B01F13/00 (Otros mezcladores; Instalaciones para efectuar mezclas, incluyendo combinaciones de mezcladores de tipos diferentes)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Análisis automático no limitado a procedimientos... > G01N35/10 (Dispositivos para transferir las muestras hacia, en, o desde el aparato de análisis, p. ej. dispositivos de aspiración, dispositivos de inyección)
  • SECCION B — TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES > PROCEDIMIENTOS O APARATOS FISICOS O QUIMICOS EN GENERAL > PROCEDIMIENTOS QUIMICOS O FISICOS, p. ej. CATALISIS,... > B01J19/00 (Procedimientos químicos, físicos o físico-químicos en general (tratamiento físico de las fibras, hilos, hilados, tejidos, plumas o artículos fibrosos hechos de estas materias, ver los lugares apropiados para dicho tratamiento, p. ej. D06M 10/00 ); Aparatos apropiados (accesorios, cargas o rejillas especialmente adaptadas para el tratamiento biológico del agua, agua residual o de alcantarilla C02F 3/10; placas o rejillas de chapoteo especialmente adaptadas para los enfriadores por chorreo F28F 25/08))
  • SECCION B — TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES > PROCEDIMIENTOS O APARATOS FISICOS O QUIMICOS EN GENERAL > MEZCLA, p. ej. DISOLUCION, EMULSION, DISPERSION (mezcla... > Mezcla, p. ej. dispersión, emulsión, según las... > B01F3/08 (de líquidos con líquidos; Emulsión)
  • SECCION B — TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES > PROCEDIMIENTOS O APARATOS FISICOS O QUIMICOS EN GENERAL > APARATOS DE LABORATORIO PARA LA QUIMICA O LA FISICA,... > B01L7/00 (Aparatos de calentamiento o de enfriamiento (evaporadores B01D 1/00; secado de gases o vapores, p. ej. desecadores, B01D 53/26; autoclaves B01J 3/04; hornos de secado F26B; altos hornos, hornos F27 ); Dispositivos de aislamiento térmico)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > TECNOLOGIA COMBINATORIA > QUIMICA COMBINATORIA; BIBLIOTECAS, p. ej. QUIMIOTECAS,... > Bibliotecas per se , p. ej. arrays, mezclas > C40B40/06 (Bibliotecas que contienen nucleótidos o polinucleótidos, o sus derivados)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > TECNOLOGIA COMBINATORIA > QUIMICA COMBINATORIA; BIBLIOTECAS, p. ej. QUIMIOTECAS,... > Aparatos especialmente adaptados para su empleo en... > C40B60/14 (para la creación de bibliotecas)

PDF original: ES-2432040_T3.pdf

 

google+ twitter facebook

Fragmento de la descripción:

Amplificación de ácido nucleico con emulsión de flujo continuo

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Realizaciones de la presente invención se refieren a métodos y a sistemas para PCR de flujo continuo usando emulsión y soporte sólido para inmovilizar ácidos nucleicos amplificados.

ANTECEDENTES

La capacidad para amplificar una pluralidad de secuencias de ácido nucleico, tales como una biblioteca genómica o una biblioteca de ADNc, es crítica dados los métodos actuales de secuenciación. Las tecnologías de secuenciación actuales requieren millones de copias de ácido nucleico por reacción de secuenciación, por tanto, se necesita la amplificación del ADN inicial antes de la secuenciación genómica. Además, la secuenciación de un genoma humano requeriría decenas de millones de reacciones de secuenciación diferentes.

Las técnicas y los sistemas actuales para la amplificación de genoma in vitro implican protocolos de clonación y cultivo laboriosos que han limitado la utilidad de la secuenciación genómica. Otras técnicas, tales como PCR, aunque son rápidas y fiables, no pueden amplificar una mezcla de fragmentos diferentes de ADN de un genoma, de una manera representativa y clonal.

Aunque la PCR con cebado al azar puede diseñarse fácilmente mediante ingeniería para amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos en una reacción, este método no se prefiere porque el producto amplificado será una mezcla de diferentes fragmentos de ADN a partir de la biblioteca. Además, en un entorno de PCR al azar a partir de una pluralidad de fragmentos, algunas secuencias de ADN se amplifican de manera preferencial a expensas de otras secuencias de manera que el producto amplificado no representa el material de partida. Este problema con la PCR puede superarse si cada miembro individual de una biblioteca se amplifica en una reacción separada.

Sin embargo, este enfoque puede no ser práctico si se requieren muchos miles de tubos de reacción separados para el procedimiento de amplificación, ya que una biblioteca genómica o biblioteca de ADNc puede incluir más de 1.000.000 fragmentos. La amplificación individual de cada fragmento de estas bibliotecas en tubos de reacción convencionales separados no resulta práctica.

Chiou et al. ANALYTICAL CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. COLUMBUS, US, vol. 73, n.º 9, 1 de mayo de 2001 () , páginas 2018-2021, da a conocer una máquina de PCR mediante termociclado en ciclo cerrado.

Schneegass et al. Lab on a Chip, Royal Society of Chemistr y vol. 1, n.º 1, septiembre de 2001 (09-2001) se refiere a PCR de flujo a través miniaturizada con diferentes tipos de molde en un termociclador en chip de silicio.

El documento WO 2004/083443 se refiere a la amplificación en sistemas de alto rendimiento con el fin de detectar moléculas poco frecuentes en muestras complejas de las que se obtienen alícuotas para dar mezclas de reacción con un número de copias bajo.

Dressman et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 22 JUL 2003, vol. 100, n.º 15, 22 de julio de 2003 () , páginas 8817-8822, se refiere a transformar moléculas de ADN individuales en partículas magnéticas fluorescentes para la detección y enumeración de variaciones genéticas.

Schneegas y Köhler, 2001, págs. 101-121 proporcionan una revisión de PCR de flujo a través en termocicladores en chip.

El documento US2002/0119459 da a conocer microcápuslas formadas mediante emulsificación de agua en aceite, en las que los microrreactores contienen los reactivos requeridos para la amplificación de ácido nucleico, y un medio de creación de una emulsión.

El documento US6310354 describe métodos de amplificación de ácido nucleico usando micropartículas en fase sólida para medir de manera cuantitativa reacciones de amplificación de ácido nucleico.

El documento US2002/0168279 da a conocer una bomba de jeringa que puede dispensar pequeños volúmenes de líquidos en la que se usan medios electrostáticos para desprender la gotita expulsada.

El documento US2002/0001675 describe un dispensador piezoeléctrico para formar gotitas que comprende un constrictor piezoeléctrico dispuesto alrededor de un tubo capilar que tiene una boquilla.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona métodos y sistemas para amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos (por ejemplo, cada secuencia de una biblioteca de ADN, transcriptoma o genoma) de una manera rápida y económica usando un medio para encapsular una pluralidad de muestras de ADN de manera eficaz individualmente en una microcápsula de una emulsión (es decir, un “microrreactor”) , realizando la amplificación de la pluralidad de muestras de ácido nucleico encapsuladas simultáneamente, y liberando la pluralidad amplificada de ADN de las microcápsulas para reacciones posteriores.

Por consiguiente, en una realización de la invención se proporciona un método para amplificar un material genético que comprende:

(i) emulsionar un fluido acuoso que comprende una mezcla de reacción de PCR y una pluralidad de perlas suspendidas en un flujo continuo de aceite para crear una pluralidad de microrreactores acuosos encapsulados en un flujo continuo de aceite,

en el que una pluralidad de los microrreactores incluyen cada uno una o más especies de molde de ácido nucleico y una perla individual que puede capturar un molde de ácido nucleico y reactivos suficientes para amplificar el número de copias de una o más especies del molde de ácido nucleico,

y en el que emulsionar comprende bombear un aceite de emulsión y el fluido que comprende la mezcla de reacción de PCR y las perlas suspendidas al interior de un emulsificador de flujo cruzado que comprende uno o más elementos en T de inyección (mezclado) y un dispositivo vibratorio antiobstrucción para evitar que las perlas obstruyan una boquilla del uno o más elementos en T de inyección; y

(ii) procesar térmicamente la emulsión que comprende la pluralidad de microrreactores acuosos haciéndola fluir a través de zonas estacionarias de temperatura controlada para amplificar la una o más especies de molde de ácido nucleico mediante reacción en cadena de la polimerasa, en el que la perla individual captura las copias amplificadas de la una o más especies de molde de ácido nucleico; y

(iii) romper la emulsión para recuperar las perlas y los moldes de ácido nucleico amplificados capturados.

En otra realización de la presente invención, se proporciona un aparato para amplificar material genético que comprende:

al menos un dispositivo de suministro de fluido;

al menos una zona de primera temperatura para someter a ciclado una pluralidad de microrreactores acuosos que incluyen cada uno una o más especies de moldes de ácido nucleico hasta una primera temperatura;

al menos una zona de segunda temperatura para someter a ciclado la pluralidad de microrreactores acuosos hasta una segunda temperatura inferior a la primera temperatura;

un primer conducto para hacer fluir al menos una corriente continua de aceite en el mismo desde un primer depósito;

un segundo conducto para hacer fluir al menos una disolución de PCR a base de agua que incluye moldes de ácido nucleico, una pluralidad de perlas que pueden capturar un molde de ácido nucleico y reactivo de PCR desde un segundo depósito;

un emulsificador de flujo cruzado que comprende un orificio para el suministro de la disolución de PCR a base de agua desde el segundo conducto al interior del primer conducto para crear una emulsión de agua en aceite en un flujo continuo, en el que el emulsificador de flujo cruzado comprende uno o más elementos en T de inyección (mezclado) y... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para amplificar material genético que comprende:

(i) emulsionar un fluido acuoso que comprende una mezcla de reacción de PCR y una pluralidad de perlas suspendidas en un flujo continuo de aceite para crear una pluralidad de microrreactores acuosos encapsulados en un flujo continuo de aceite,

en el que una pluralidad de los microrreactores incluyen cada uno una o más especies de molde de ácido nucleico y una perla individual que puede capturar un molde de ácido nucleico y reactivos suficientes para amplificar el número de copias de una o más especies del molde de ácido nucleico,

y en el que emulsionar comprende bombear un aceite de emulsión y el fluido que comprende la mezcla de reacción de PCR y las perlas suspendidas en un emulsificador de flujo cruzado que comprende uno o más elementos en T de inyección (mezclado) y un dispositivo vibratorio antiobstrucción para evitar que las perlas obstruyan una boquilla del uno o más elementos en T de inyección; y

(ii) procesar térmicamente la emulsión que comprende la pluralidad de microrreactores acuosos haciéndola fluir a través de zonas estacionarias de temperatura controlada para amplificar la una o más especies de molde de ácido nucleico mediante reacción en cadena de la polimerasa, en el que la perla individual captura las copias amplificadas de la una o más especies de molde de ácido nucleico; y

(iii) romper la emulsión para recuperar las perlas y los moldes de ácido nucleico amplificados capturados.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende además filtrar la emulsión de agua en aceite para recoger uno o más de los moldes de ácido nucleico amplificados.

3. Método según la reivindicación 1, en el que la perla tiene un diámetro de entre aproximadamente 2 micrómetros y aproximadamente 100 micrómetros.

4. Método según la reivindicación 1, en el que las especies de molde de ácido nucleico se seleccionan del grupo que consiste en ADN genómico, ADNc, ADN episomal, ADN de BAC y ADN de YAC.

5. Método según la reivindicación 1, en el que las perlas se seleccionan del grupo que consiste en perlas de Sepharose, perlas sólidas y perlas monodispersadas.

6. Método según la reivindicación 1, en el que se distribuye uniformemente una pluralidad de los microrreactores acuosos a lo largo del flujo continuo.

7. Método según la reivindicación 1, en el que la dimensión de los microrreactores acuosos es de 10 a 50 veces menor que el diámetro del tubo de flujo continuo.

8. Método según la reivindicación 1, en el que el flujo se dirige mediante un conducto a través de un dispositivo de procesamiento térmico, que expone el flujo continuo a zonas alternas de una temperatura superior y temperatura inferior.

9. Método según la reivindicación 8, en el que el conducto se selecciona del grupo que consiste en un conducto de acero inoxidable, un conducto de politetrafluoroetileno (PTFE) y un conducto de sílice fundida.

10. Método según la reivindicación 8, en el que el dispositivo de procesamiento térmico comprende un mandril, en el que el conducto se enrolla helicoidalmente alrededor del mandril que comprende una zona de primera temperatura y una zona de segunda temperatura.

11. Método según la reivindicación 8, en el que el dispositivo de procesamiento térmico comprende secciones alternas del conducto, en el que las secciones alternas de conducto son lineales y comprenden una zona de primera temperatura controlada y una segunda sección comprende una zona de segunda temperatura controlada.

12. Método según la reivindicación 11, en el que las secciones alternas del conducto están situadas adyacentes opuestas a la zona de primera temperatura lineal y la zona de segunda temperatura.

13. Método según la reivindicación 1, en el que:

14. Método según la reivindicación 13, en el que:

la tasa controlada comprende una tasa de formación de gotitas de 500 a 1000 gotitas de emulsión por segundo.

15. Método según la reivindicación 13, en el que:

la tasa controlada comprende una tasa de formación de gotitas de más de 1000 gotitas de emulsión por segundo.

16. Método según la reivindicación 1, en el que: el flujo continuo de aceite fluye a una tasa constante.

17. Método según la reivindicación 16, en el que: la tasa constante incluye una tasa de aproximadamente 1-10 ml/min.

18. Método según la reivindicación 16, en el que: la tasa constante incluye una tasa de aproximadamente 3 ml/min.

19. Método según la reivindicación 1, en el que: el dispositivo vibratorio antiobstrucción es un accionador piezoeléctrico o un accionador electromagnético.

20. Aparato para amplificar material genético que comprende:

los microrreactores acuosos se forman a una tasa controlada.

al menos un dispositivo de suministro de fluido;

al menos una zona de primera temperatura para someter a ciclado una pluralidad de microrreactores acuosos que incluyen cada uno una o más especies de moldes de ácido nucleico hasta una primera temperatura;

al menos una zona de segunda temperatura para someter a ciclado la pluralidad de microrreactores acuosos hasta una segunda temperatura inferior a la primera temperatura;

un primer conducto para hacer fluir al menos una corriente continua de aceite en el mismo desde un primer depósito;

un segundo conducto para hacer fluir al menos una disolución de PCR a base de agua que incluye moldes de ácido nucleico, una pluralidad de perlas que pueden capturar un molde de ácido nucleico y reactivo de PCR desde un segundo depósito;

un emulsificador de flujo cruzado que comprende un orificio para el suministro de la disolución de PCR a base de agua desde el segundo conducto al interior del primer conducto para crear una emulsión de agua en aceite en un flujo continuo, en el que el emulsificador de flujo cruzado comprende uno o más elementos en T de inyección (mezclado) y un dispositivo vibratorio antiobstrucción para evitar que las perlas obstruyan una boquilla del uno o más elementos en T de inyección, y en el que la emulsión de agua en aceite comprende una pluralidad de gotitas que comprenden los microrreactores para realizar reacciones en cadena de la polimerasa, y en el que una pluralidad de los microrreactores incluyen cada uno una o más especies de molde de ácido nucleico y una perla individual que puede capturar un molde de ácido nucleico.

21. Aparato para amplificar material genético según la reivindicación 20, en el que aguas abajo del orificio, un tramo del primer conducto desde una posición de partida hasta una posición de terminación está dispuesto con respecto a al menos las zonas de primera y segunda temperatura de tal manera que el tramo del primer conducto está expuesto a procedimientos alternos de calentamiento y enfriamiento a una temperatura y durante un tiempo suficientes para amplificar cualquiera de los moldes de ácido nucleico mediante reacción en cadena de la polimerasa.

22. Aparato según la reivindicación 20, en el que el orificio tiene un tamaño de entre 50 !m y 300 !m, y opcionalmente tiene un tamaño de aproximadamente 150 !m.

23. Aparato según la reivindicación 20, en el que un área de intersección del orificio y el primer conducto incluye un diámetro de entre más de 50 !m y aproximadamente 800 !m, y opcionalmente un diámetro de

aproximadamente 400 !m.

24. Aparato según la reivindicación 20, que comprende además medios de recogida para recoger uno o más de los moldes de ácido nucleico amplificados desde el primer conducto aguas abajo de las fuentes de calentamiento y enfriamiento.

25. Aparato según la reivindicación 24, en el que los medios de recogida comprenden un filtro.

26. Aparato según la reivindicación 20, en el que las zonas de primera y segunda temperatura están dispuestas circunferencialmente en lados opuestos de una superficie curvada, en el que el tramo del primer conducto está enrollado helicoidalmente alrededor de la superficie curvada para proporcionar partes alternas del tramo de primer conducto adyacentes o bien a la zona de primera temperatura o bien a la zona de segunda temperatura.

27. Aparato según la reivindicación 26, en el que la superficie curvada comprende un mandril.

28. Aparato según la reivindicación 20, en el que las zonas de temperatura están dispuestas a lo largo de superficies lineales de calentamiento y enfriamiento opuestas, respectivamente, en el que el tramo de primer conducto está enrollado a lo largo de las superficies opuestas de tal manera que partes del tramo de primer conducto están expuestas de manera alterna a las superficies de calentamiento y enfriamiento una pluralidad de veces.

29. Aparato según la reivindicación 28, en el que las superficies lineales son sustancialmente verticales u horizontales.

30. Aparato según la reivindicación 20, además los moldes de ácido nucleico se capturan sobre perlas, en el que las perlas tienen un diámetro de entre aproximadamente 2 micrómetros y aproximadamente 100 micrómetros.

31. Aparato según la reivindicación 30, en el que la perla se selecciona del grupo que consiste en una perla de Sepharose, una perla sólida y una perla monodispersada.