Alteración en la expresión de la proteína DELLA u ortóloga para alterar el patrón de crecimiento de las plantas y el contenido de metabolitos del fruto.

La presente invención describe nuevas funciones del gen SIDELLA de Solanum lycopersicum así como sus usos y versiones mutantes del gen asociadas a nuevos fenotipos que suponen la modificación del hábito de crecimiento y del metabolismo de las plantas portadoras de esas alteraciones así como cierta influencia en el contenido de metabolitos del fruto del tomate.

Alteración en la expresión de la proteína DELLA u ortóloga para alterar el patrón de crecimiento de las plantas y el contenido de metabolitos del fruto.

Sector técnico de la invención La presente invención describe nuevas funciones del gen SlDELLA de Solanum lycopersicum así como sus usos y versiones mutantes del gen asociadas a nuevos fenotipos que suponen la modificación del hábito de crecimiento y del metabolismo de las plantas portadoras de esas alteraciones que resulta en una alteración en el contenido de metabolitos del fruto del tomate.

Antecedentes de la invención En general la arquitectura final de una planta depende del número, tamaño y porte de los elementos constituyentes (hojas, entrenudos, flores y frutos) y de la forma en la que se insertan en el cuerpo general de la planta. Incluso más importante que lo anterior es el hábito de crecimiento.

La productividad de una planta resulta afectada por factores genéticos, fisiológicos y medioambientales, pero la propia arquitectura y hábito de crecimiento son determinantes clave.

La planta del tomate (Solanum lycopersicum) es de la familia de las solanáceas (Solanaceae) originaria de América y cultivada en todo el mundo por su fruto comestible, el cual es una baya coloreada de tonos que van del amarillento al rojo, debido a la presencia de los pigmentos licopeno y caroteno. Posee un sabor ligeramente ácido y se produce y consume en todo el mundo tanto fresco como procesado de diferentes modos.

Por el hábito de crecimiento, que va a estar dado por el tipo de ramificaciones de las plantas, se reconocen dos grandes grupos de variedades, las de crecimiento indeterminado y las de crecimiento determinado. El primer grupo se caracteriza por tener un ápice vegetativo con dominancia, que le confiere crecimiento continuo al tallo o eje principal. Se reconocen fácilmente ya que presentan un racimo floral cada tres hojas y un crecimiento radial amplio. En las variedades de crecimiento determinado los brotes siempre terminan en una inflorescencia, por lo tanto siempre se debe dejar el brote axilar superior para conducirla como indeterminada. Este grupo de variedades, las cuales también se denominan “arbustivas”, no requieren soporte durante su crecimiento. Las variedades arbustivas enanas son un subgrupo dentro de las variedades determinadas caracterizadas por su menor tamaño y por producir frutos del tipo “cereza” o “cherr y ”.

El cuidar el sabor del tomate no es tarea fácil. La intensidad de las propiedades del sabor del fruto de tomate está determinado por la cantidad de azúcar (fructosa y glucosa principalmente) , por el contenido de ácidos orgánicos (cítrico y málico principalmente) y la composición de los compuestos volátiles. La diferencia de sabores entre variedades se explican por la diferencia de las proporciones cuantitativas de las sustancias volátiles, muchas de las cuales se desarrollan durante la maduración.

La solicitud de patente ES 2235335 T3 describe un procedimiento de manipulación del aroma de productos del tomate, que consiste en incubar trozos de tomate con una enzima con actividad alcohol deshidrogenasa y un cofactor de alcohol deshidrogenasa; así como los productos obtenidos por este procedimiento.

Las plantas de crecimiento simpodial tienen un tipo de crecimiento lateral peculiar en el que el meristemo apical termina (aborta o se diferencia en una flor/meristemo inflorescente) pero la planta continua creciendo a partir del meristemo axilar normalmente localizado por debajo de la hoja superior, lo que se repite después de unos cuantos nodos foliares, provocando un crecimiento apical continuado.

Las plantas de tomate exhiben un patrón de crecimiento simpodial caracterizado por la alternancia en los brotes de órganos vegetativos y reproductivos. Este patrón se establece después de un periodo inicial en el que solo se producen órganos vegetativos (tallos/entrenudos y hojas en la parte aérea) que en el caso del tomate supone la producción de unos 5 a 20 nodos foliares que acaba con la formación, en el meristemo apical del brote principal, de un meristemo inflorescente que supone la terminación de dicho simpodio principal. El crecimiento de la planta no se detiene ahí, sino que continúa a partir de la yema axilar situada en la axila de la hoja más próxima a esa nueva inflorescencia. En todas las especies de tomate silvestres y la mayor parte de las de consumo en fresco el habito de crecimiento que continua a partir de aquí es la producción de simpodios cada uno consistente en unas 2 o 3 hojas y una inflorescencia en el que el nuevo simpodio se vuelve a producir a partir de la axila de la ultima hoja por debajo de la nueva inflorescencia. Ello produce una planta de gran crecimiento que produce continuamente frutos a lo largo del eje principal, con frutos de diferente estadio de maduración en cualquier momento del crecimiento post floración. Este habito de crecimiento se denomina en este caso “indeterminado”.

Por el contrario las plantas de tomate que llevan en homozigosis la mutación recesiva self-pruning sp (sp/sp) solo producen dos o tres brotes simpodiales después de la primera inflorescencia consistentes cada uno en 2 ó 3 hojas y una inflorescencia, tras lo cual producen 2 inflorescencias seguidas y cesa así el crecimiento. Esta mutación confiere un hábito de crecimiento “determinado” que además de afectar el porte de la planta resulta en un cuajado y maduración de frutos más concentrada en el tiempo de lo que ocurre en las plantas de crecimiento indeterminado (Stevens y Rick, 1986; Yeager, 1927) .

El locus self-pruning (SP) ha sido clonado (Pnueli et al., 1998) y demostrado ser un ortólogo de los genes Centroradialis (CEN) de Antirrhinum y Terminal Flower (TFL1) de Arabidopsis. La familia de genes denominada a partir de estos tres “CETS” (de CEN, TFL1 y SP) , están conservados entre diferentes especies vegetales donde afectan la floración y la determinación/indeterminación (Pnueli et al., 2001, Foucher et al., 2003) .

En el caso del tomate, SP pertenece a una pequeña familia génica de seis miembros (SP, SP2I, SP3D, SP5G, SP6A, and SP9D) distribuidos en cinco cromosomas (Carmel-Goren et al., 2003) , si bien el causante de la mutación sp que esta en el cromosoma seis es el único demostrado que puede controlar el paso entre habito de crecimiento determinado e indeterminado. Los otros parálogos de SP en tomate no están muy caracterizados pero parecen afectar la expresión del fenotipo determinado modificando el momento en el que se determina la planta (caso de introgresiones de SP9D y de SP5G de pennelli en M82 (Carmel-Goren et al., 2003; Eshed and Zamir, 1995; Jones et al., 2007) .

La mutación self-pruning ha sido introducida en la mayor parte de las variedades de tomate de industria, ya que favorece la recolección mecánica (Hanna et al., 1966; Friedland y Barton, 1975; Stevens y Rick, 1986; Yeager, 1927) y no se dispone de métodos alternativos o que modulen la expresión de SP.

Por otra parte, las proteínas DELLA se han descrito como elementos clave que integrarían tanto señales externas como las mediadas por fitohormonas, adaptando el crecimiento de las plantas a las necesidades y condiciones medioambientales.

Las proteínas DELLA son miembros de una subfamilia GRAS de reguladores que parecen actuar a nivel nuclear como represores de procesos de desarrollo y crecimiento. Según el modelo actual, elaborado fundamentalmente a partir del trabajo realizado en Arabidopsis y arroz, el bloqueo en el crecimiento ejercido por las proteínas DELLA (una familia de cinco miembros en Arabidopsis, pero uno solo en el arroz) y en la mayor parte de los cultivos, incluido el tomate, sería eliminado por degradación dirigida de la proteína DELLA (Dill et al., 2001; Dill y Sun, 2001; Lee et al., 2002; Peng et al., 1997; Richards et al., 2001; Wen y Chang, 2002) . El mecanismo de acción subyacente al efecto de inducción del crecimiento de las fitohormonas giberelinas (GA) estaría basado en que tras la unión de la GA al receptor GID se produciría un cambio conformacional de la proteína que favorecería su interacción con DELLA y aumentaría su afinidad a ser degradada por el proteosoma 26S. (Murase et al, 2007; Ueguchi-Tanaka et al, 2007; 2008) .

Por lo que respecta al crecimiento y programas de desarrollo, parece ser que la ruta DELLA integra la transición floral en respuesta a la luz, al etileno y a las auxinas entre otras y actuarían afectando la estabilidad de la proteínas DELLA, su transcripción... [Seguir leyendo]

1. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga caracterizada porque la alteración en la expresión de la proteína DELLA produce una inhibición en la represión del desarrollo y crecimiento de las plantas en comparación a plantas correspondientes no modificadas genéticamente.

2. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicación 1, caracterizada porque dicha alteración se obtiene mediante silenciamiento del gen SlDELLA u ortólogo.

3. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicación 2, caracterizada porque el silenciamiento se obtiene empleando una construcción génica que se basa en una copia antisentido del gen -SlDELLA controlada por el promotor 2XCaMV35S.

4. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicación 1, caracterizada porque dicha alteración se obtiene mediante mutación del gen SlDELLA u ortólogo.

5. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicación 4, caracterizada porque la mutación en la secuencia genética de SlDELLA se debe a adición y/o inserción y/o supresión y/o sustitución de uno o más nucleótidos de gen SlDELLA u ortólogo.

6. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicación 5, caracterizada porque la mutación consiste en la sustitución del nucleótido guanina por el nucleótido adenina en el nucleótido 458.

7. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicación 6, caracterizada porque la mutación en la secuencia genética de SlDELLA es la denominada TILLING 1 (SEQ ID No 3) .

8. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicación 5, caracterizada porque la mutación consiste en la sustitución del nucleótido guanina por el nucleótido adenina en el nucleótido 1498.

9. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicación 8, caracterizada porque la mutación en la secuencia genética de SlDELLA es la denominada TILLING 2 (SEQ ID No.5) .

10. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicación 5, caracterizada porque la mutación consiste en la sustitución del nucleótido citosina por timina en el nucleótido

994.

11. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicación 10, caracterizada porque la mutación en la secuencia genética de SlDELLA es la denominada TILLING 3 (SEQ ID No.7) .

12. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicación 5, caracterizada porque la mutación consiste en la sustitución del nucleótido citosina por timina en el nucleótido

661.

13. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicación 12, caracterizada porque la mutación en la secuencia genética de SlDELLA es la denominada TILLING 4 (SEQ ID No.9) .

14. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicaciones1a13 caracterizada porque la planta exhibe un patrón de crecimiento simpodial.

15. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicaciones 1 a 14 caracterizada porque el patrón de crecimiento simpodial determinado se modifica a indeterminado.

16. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicaciones1a14 caracterizada porque el patrón de crecimiento simpodial determinado se modifica a semideterminado.

17. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicaciones 1 a 13 caracterizada porque el contenido de metabolitos y/o algunas sustancias volátiles y/o no asociadas al aroma de los frutos se ve aumentado respecto a plantas correspondientes no modificadas genéticamente.

18. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicaciones1a13 caracterizada porque el contenido de algunas sustancias volátiles asociadas y/o no asociadas al aroma de los frutos se ve reducido respecto a plantas correspondientes no modificadas genéticamente.

19. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicación 17 caracterizada porque el aumento en el contenido dejos metabolitos sacarosa, tirosina, asparagina, isoleucina, treonina, prolina, ácido piroglutámico y mio-inositol es del orden de.

10. 400%, y/o el de fructosa y glucosa es del orden del 10-30%, y/o el de las sustancias volátiles asociadas al aroma de los frutos E-2-hexenal, 1-penten-3-ona y β.damascenona es del orden de.

10. 200%, y/o el de las sustancias volátiles no asociadas al aroma de los frutos ácido 3-metilbutanoico, E, E-2, 4-decadienal y E-2-octenal es del orden de.

10. 200% respecto de plantas correspondientes no modificadas genéticamente.

20. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicación 18 caracterizada porque la disminución en el contenido de las sustancias volátiles asociadas al aroma de los frutos 3-metilbutanol, 1-nitro-2-feniletano, 2-feniletanol, fenilacetaldehído y 2-isobutiltiazol es del orden del 8090%, y/o la de las sustancias volátiles no asociadas al aroma de los frutos geranilacetona, terpineol, linalool, bencil alcohol, eugenol, benzilnitrilo, 2-metil-1-butanol y 2-metil-1-propanol es del orden de.

5. 100% respecto de plantas correspondientes no modificadas genéticamente.

21. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicaciones1a20 caracterizada porque la planta tiene un interés comercial y/o agrícola.

22. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicación 21 caracterizada porque dicha planta se selecciona del grupo de las solanaceas, cucurbitáceas, orquidáceas y/o leñosas.

23. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicación 22 caracterizada porque la planta pertenece a la familia de las Solanáceas.

24. Planta genéticamente modificada con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga según reivindicación 23 caracterizada porque la planta genéticamente modificada es una planta de tomate, Solanum lycopersicum.

25. Fruto de la planta genéticamente modificada según reivindicaciones 1 a 24 caracterizado porque el contenido de metabolitos y/o sustancias volátiles asociadas y/o no asociadas al aroma de los frutos está aumentado respecto a los frutos de plantas correspondientes no modificadas genéticamente.

26. Fruto de la planta genéticamente modificada según reivindicaciones 1 a 24 caracterizado porque el contenido de algunas sustancias volátiles asociadas y/o no asociadas al aroma de los frutos está reducido respecto a los frutos de plantas correspondientes no modificadas genéticamente.

27. Fruto de la planta genéticamente modificada según reivindicación 25 caracterizado porque aumento del contenido de metabolitos sacarosa, tirosina, asparagina, isoleucina, treonina, prolina, ácido piroglutámico y mio-inositol es del orden de.

10. 400%, y/o el de fructosa y glucosa es del orden del 10-30%, y/o el de las sustancias volátiles asociadas al aroma de los frutos E-2-hexenal, 1-penten-3-ona y β.damascenona es del orden de.

10. 200%, y/o el de las sustancias volátiles no asociadas al aroma de los frutos ácido 3-metilbutanoico, E, E-2, 4-decadienal y E-2-octenal es del orden de.

10. 200% respecto a los frutos de plantas correspondientes no modificadas genéticamente.

28. Fruto de la planta genéticamente modificada según reivindicación 26 caracterizado porque la disminución de las sustancias volátiles asociadas al aroma de los frutos 3-metilbutanol, 1-nitro-2-feniletano, 2-feniletanol, fenilacetaldehído y 2-isobutiltiazol es del orden de.

8. 90%, y/o la de las sustancias volátiles no asociadas al aroma de los frutos geranilacetona, terpineol, linalool, bencil alcohol, eugenol, benzilnitrilo, 2-metil-1-butanol y 2-metil-1-propanol es del orden de.

5. 100% respecto a los frutos de plantas correspondientes no modificadas genéticamente.

29. Fruto según reivindicacione.

2. 28 caracterizado porque el fruto es el tomate.

30. Semilla de la planta genéticamente modificada según reivindicaciones1a29 caracterizada porque la expresión de la proteína DELLA se encuentra alterado.

31. Procedimiento de obtención de plantas genéticamente modificadas con la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a) transformar el genoma de una célula de la planta, b) regenerar la planta a partir de la célula de la etapa a) , c) obtener semillas de las planta transformada que contengan el genoma modificado y, d) crecer al menos una de las semillas de la etapa c) para obtener una planta que contenga la expresión alterada de la proteína DELLA u ortóloga.

32. Procedimiento según reivindicación 31 caracterizado porque la etapa a) consiste en una mutagénesis dirigida.

33. Procedimiento según reivindicación 32 caracterizado porque la mutagénesis dirigida consiste en silenciar el gen SlDELLA.

34. Procedimiento según reivindicación 33 caracterizado porque para el silenciamiento de la etapa a) se emplea la construcción génica asDELLA.

35. Procedimiento según reivindicación 34 caracterizado porque la construcción génica se basa en una copia antisentido del gen SlDELLA controlada por el promotor 2XCaMV35S.

36. Procedimiento según reivindicación 32 caracterizado porque la mutagénesis dirigida de la etapa a) consiste en modificar la secuencia nativa del gen SlDELLA a la secuencia del gen SlDELLA mutado seleccionado del grupo de las mutaciones denominadas TILLING 1 (SEQ ID No 3) , TILLING 2 (SEQ ID No 5) , TILLING 3 (SEQ ID No 7) ,

o TILLING 4 (SEQ ID No 9) .

37. Procedimiento según reivindicación 31 caracterizado porque la etapa b) es opcional.

38. Procedimiento según reivindicación 37 caracterizado porque la etapa b) se realiza mediante transformación mediada por Agrobacterium.

39. Procedimiento según reivindicación 31 caracterizado porque la etapa a) consiste en una mutagénesis no dirigida que comprende las siguientes etapas:

40. Procedimiento según reivindicación 39 caracterizado porque el agente mutagénico de la etapa i) es etilmetanosulfonato.

41. Procedimiento según la reivindicación 39 caracterizado porque en la etapa (iv) se seleccionaron 4 formas alélicas de SlDELLA.

42. Procedimiento según las reivindicaciones 39 a 41, caracterizado porque en la etapa (iv) una de las 4 formas alélicas de SlDELLA es la denominada TILLING 1 (SEQ ID No.3) .

43. Procedimiento según las reivindicaciones 39 a 41, caracterizado porque en la etapa (iv) una de las 4 formas alélicas de SlDELLA es la denominada TILLING 2 (SEQ ID No.5) .

44. Procedimiento según las reivindicaciones 39 a 41, caracterizado porque en la etapa (iv) una de las 4 formas alélicas de SlDELLA es la denominada TILLING 3 (SEQ ID No.7) .

45. Procedimiento según las reivindicaciones 39 a 41, caracterizado porque en la etapa (iv) una de las 4 formas alélicas de SlDELLA es la denominada TILLING 4 (SEQ ID No.9) . i. exponer la planta a un agente mutagénico, ii. extraer el DNA de cada una de las familias y combinar siguiendo una estrategia 3D, iii. rastrear el gen SlDELLA en cada familia mediante PCR anidada y cebadores específicos y universales, iv. detectar los alelos mutantes de SlDELLA por secuenciación y deconvolución.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Universidad Politécnica de Valencia y Consejo Superior de Investigaciones Científicas <120> ALTERACIÓN EN LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA DELLA U ORTÓLOGA PARA PARA ALTE-

RAR EL PATRÓN DE CRECIMIENTO DE LAS PLANTAS Y EL CONTENIDO DE METABOLITOS DEL FRUTO

<130> Gen SlDELLA

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1767

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> SlDELLA Rutgers <400> 1

<210> 2

<211> 588

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> SlDELLA Rutgers <400> 2

ES 2 364 932 A1

<210> 3

<211> 1767

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Mutante TILLING 1

<400> 3 <210> 4

<211> 588

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Mutante TILLING 1

ES 2 364 932 A1

<400> 4

ES 2 364 932 A1

<210> 5

<211> 1773

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Mutante TILLING 2

<400> 5 <210> 6

<211> 588

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Mutante TILLING 2

<400> 6

ES 2 364 932 A1

<210> 7

<211> 1773

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Mutante TILLING 3

<400> 7 <210> 8

<211> 588

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Mutante TILLING 3

ES 2 364 932 A1

<400> 8

ES 2 364 932 A1

<210> 9

<211> 1773

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Mutante TILLING 4

<400> 9 <210> 10

<211> 588

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Mutante TILLING 4

<400> 10

ES 2 364 932 A1

<210> 11

<211> 1767

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> SlDELLA M82 Det

ES 2 364 932 A1

<400> 11

<210> 12

<211> 588

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> SlDELLA M82 Det

<400> 12

ES 2 364 932 A1

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> oligonucleótidos TGxC7

<400> 13

ccagcacttg tcattcttac c

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> oligonucleótidos TGxC8

<400> 14

catctctctc attgtctctt cc

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> oligonucleótido SlDELLA-ext-F1

22 <400> 15

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Cebador M13R800

<400> 20 ggataacaat ttcacacagg