Aislamiento, propagación y diferenciación dirigida de células madre a partir del sistema nervioso central de mamíferos.

LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO IN VITRO MEDIANTE EL CUAL UNA POBLACION HOMOGENEA DE CELULAS PRECURSORAS PLURIPOTENCIALES PROCEDENTES DEL NEUROEPITELIO EMBRIONICO DE MAMIFEROS

(CELULAS MADRE SNC), SE PUEDE MULTIPLICAR HASTA 10 SUP,9 VECES EN CULTIVO, MANTENIENDO SIMULTANEAMENTE SU CAPACIDAD DE DIFERENCIARSE EN NEURONAS, OLIGODENDROCITOS Y ASTROCITOS. SE PRESENTAN CONDICIONES QUIMICAMENTE DEFINIDAS, QUE PERMITEN DERIVAR UN GRAN NUMERO DE NEURONAS, HASTA EL 50 % DE LAS CELULAS MULTIPLICADAS, A PARTIR DE LAS CELULAS MADRE. ADEMAS, SE HAN IDENTIFICADO CUATRO FACTORES - PDGF, CNTF, LIF Y T3 - QUE GENERAN, INDIVIDUALMENTE, UNA PROPORCION SIGNIFICATIVAMENTE MAYOR DE NEURONAS, ASTROCITOS U OLIGODENDROCITOS. DICHOS PROCEDIMIENTOS DEFINIDOS PERMITEN UNA PREPARACION A GRAN ESCALA DE CELULAS MADRE DEL SNC, NEURONAS, ASTROCITOS Y OLIGODENDROCITOS, BAJO CONDICIONES DEFINIDAS QUIMICAMENTE, CON EFICIENCIA Y CONTROL. LA PRESENTE INVENCION PRESENTA ASIMISMO CULTIVOS IN VITRO DE NEURONAS MADURAS, DIFERENCIADAS EN ESTADO TERMINAL, ESPECIFICAS DE ZONA, DERIVADAS DE CULTIVOS DE CELULAS MADRE SNC PLURIPOTENCIALES, Y TAMBIEN UN PROCEDIMIENTO IN VITRO MEDIANTE EL CUAL SE PUEDEN PRODUCIR NEURONAS DIFERENCIADAS.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US1997/007669.

Solicitante: NEURALSTEM BIOPHARMACEUTICALS.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: BUILDING 335, PAINT BRANCH DRIVE COLLEGE PARK, MD 20742 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: JOHE,KARL,K.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/50 (Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q))
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen sustancias... > A61K35/12 (Sustancias procedentes de mamíferos; Composiciones que comprenden tejidos o células indeterminadas; Composiciones que comprenden células madre no embrionarias; Células modificadas genéticamente (células madre no caracterizadas A61K 35/545; vacunas o preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00))
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/94 (en los que intervienen narcóticos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/0797 (Células madre; Células progenitoras)

PDF original: ES-2292187_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Aislamiento, propagación y diferenciación dirigida de células madre del sistema nervioso central de mamíferos.

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a una tecnología en la que se aíslan células madre procedentes de cerebro embrionario y adulto, se propagan y se diferencian eficientemente en cultivo para generar grandes números de células nerviosas. Esta tecnología, por vez primera, permite generar grandes números de muchos tipos diferentes de neuronas que se encuentran en un cerebro normal y proporciona una nueva base para la terapia génica, la terapia de células, un nuevo rastreo de factores de crecimiento y un rastreo de fármacos para trastornos del sistema nervioso.

2. Descripción de la técnica relacionada

El cerebro está constituido por tipos de células nerviosas muy diversos que realizan interconexiones específicas y que, una vez destruidas, no regeneran a las células nerviosas (neuronas) . Además, el cerebro está protegido por una barrera de sangre-cerebro (hematoencefálica) que bloquea eficazmente el flujo de grandes moléculas al cerebro, haciendo ineficaz la inyección periférica de potenciales fármacos para el factor de crecimiento. Así, un reto principal al que se enfrenta actualmente la industria biotecnológica consiste en encontrar un mecanismo eficaz para suministrar potenciales productos de terapia génica directamente al cerebro con el fin de tratar trastornos del sistema nervioso.

Además, para una enfermedad degenerativa tal como el Parkinson, el enfoque más amplio para recuperar una función neuronal perdida puede ser reemplazar las células dañadas por células sanas más que simplemente un producto génico sencillo. Así, el éxito actual y futuro de la terapia génica y la terapia de células depende del desarrollo de células adecuadas que (1) puedan portar una copia sana de un gen enfermizo (es decir, un gen normal) , (2) puedan ser trasplantadas al cerebro y (3) puedan ser integradas en la red neuronal del hospedante. Este desarrollo requiere de manera ideal células de origen neuronal que (1) proliferen en cultivo hasta formar un gran número, (2) sean susceptibles a diversos métodos de transferencia de genes y (3) se integren y comporten como las células de un cerebro normal. Sin embargo, no ha habido este tipo de células para fines terapéuticos, ya que las neuronas no se dividen y, por lo tanto, no se pueden propagar en cultivo.

Como alternativas, diversas células transformadas de orígenes neurales y no neurales tales como glias, fibroblastos, e incluso células de la musculatura, que pueden proliferar en cultivo, se han utilizado como posibles vehículos para suministrar un gen de interés a las células del cerebro. Sin embargo, no se espera y no se puede esperar que células de este tipo proporcionen funciones neuronales. Otro enfoque alternativo ha sido obligar a una célula neural de origen desconocido a dividirse en cultivo modificando genéticamente alguna de sus propiedades, al tiempo que conserve algo de su capacidad de convertirse y funcionar como una neurona. A pesar de que algunas células "inmortalizadas" pueden exhibir determinadas características de una neurona, no está claro si estas células alteradas son ciertamente una alternativa viable para fines clínicos.

Un cerebro fetal en desarrollo contiene la totalidad de las células germinales para las células de un cerebro adulto, así como todos los programas necesarios para orquestarlos hacia la red final de neuronas. En las fases tempranas de desarrollo, el sistema nervioso está poblado por células germinales, de las que todas las otras células, principalmente neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, se derivan durante las subsiguientes fases de desarrollo. Claramente, células germinales de este tipo, que son precursores del desarrollo normal del cerebro serían ideales para todas las terapias basadas en genes y basadas en células, si estas células germinales pudieran aislarse, propagarse y diferenciarse en tipos de células maduras.

La utilidad de las células primarias aisladas, tanto para la investigación básica como para la aplicación terapéutica depende del grado al que las células aisladas se asemejen a las del cerebro. Se desconoce cuántos tipos diferentes de células precursoras existen en el cerebro en desarrollo. Sin embargo, pueden existir varios tipos de células distintos:

un precursor a neuronas únicamente ("progenitor neuronal comprometido" o "neuroblasto") ,

un precursor a oligodendrocitos solamente ("oligodendroblasto") ,

un precursor a astrocitos solamente ("astroblasto") ,

un precursor bipotencial que puede convertirse en neurona u oligodendrocito, neurona o astrocito y oligodendrocito o astrocito, y

un precursor multipotencial que conserva la capacidad de diferenciarse en uno cualquiera de los tres tipos de células.

El análisis del mapeo de destino y estudios de trasplante in vivo han demostrado que diferentes tipos neuronales y células no neuronales se pueden derivar de las mismas células precursoras1-5. Análisis in vitro han sugerido también que células multipotenciales están presentes en el cerebro en desarrollo6, 7. Sin embargo, el análisis del linaje solo no identifica directamente las células multipotenciales; y tampoco define los mecanismos que pueden impulsarlas a diferentes destinos. Células precursoras procedentes del sistema nervioso central (SNC) se han expandido in vitro y se ha observado8-12 una diferenciación en neuronas y glia y, según se detalla más abajo, se han obtenido tipos de células acusadamente diferentes, incluso cuando las condiciones del cultivo utilizadas eran aparentemente las mismas.

Debido a la actual falta de comprensión de la histogénesis durante el desarrollo del cerebro, muchos investigadores han utilizado diversos términos sueltos para describir las células que han estudiado, por ejemplo progenitor neuronal, precursor neural, precursor neuroepitelial, célula madre multipotencial, etc. Así, la naturaleza de las células descrita hasta la fecha en la bibliografía y las condiciones de cultivo para obtenerlas únicamente se puede comparar una con otra por su capacidad de diferenciación reseñada. El objeto completo del aislamiento, caracterización y uso de células madre procedentes del SNC ha sido recientemente revisado33, 34, 38.

En resumen, hasta la fecha no se han encontrado condiciones, a pesar de muchos informes, de identificar, propagar y diferenciar con éxito células madre multipotenciales. Una recopilación útil de estudios que informan del cultivo de células precursoras del SNC se encuentra en la Tabla 3, pág. 172 de una revisión reciente34 y que se ofrece adicionalmente en lo que sigue.

Vicario-Abejon, C., Johe, K., Hazel, T., Collazo, D. y McKay, R., Functions of basic fibroblast growth factor and neurotrophins in the differentiation of hippocampal neurons, Neuron 15, 105-114 (1995) 12.

Células expandidas por Vicario-Abejon et al. son significativamente diferentes de las descritas en la presente invención, a pesar de que el tejido de partida (hipocampo embrionario) , el mitógeno (factor de crecimiento fibroblastico básico, bFGF - siglas en inglés) , y el medio basal (N2) son similares en ambos informes. Casi todas las células expandidas por Vicario-Abejon et al. fracasaron en diferenciarse en cualesquiera tipos de células, y murieron en ausencia de bFGF (tal como se establece en el documento, pág. 106) . Esto también se refleja en la Fig. 3 del documento en el que el número de neuronas MAP2 positivas es excesivamente bajo... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para la expansión y cultivo in vitro de células madre del sistema nervioso central de un mamífero, en el que las células madre conservan la capacidad multipotencial de diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, que comprende las etapas de:

a) disociar células procedentes de tejido del sistema nervioso central mediante trituración mecánica en ausencia de cationes divalentes;

b) cultivar las células disociadas adheridas a una placa en un medio de cultivo exento de suero;

c) extender en placas células disociadas a una densidad que no exceda de 20.000 células/cm2 y, en pasos subsiguientes, volver a extender en placas las células cultivadas a una densidad que no exceda de 10.000 células/cm2;

d) añadir diariamente a las células de cultivo un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en

i) bFGF a una concentración de al menos 10 ng/ml,

ii) EGF a una concentración de al menos 10 ng/ml,

iii) TGF-alfa a una concentración de al menos 10 mg/ml, y

iv) aFGF a una concentración de al menos 10 ng/ml más 1 μg/ml de heparina;

e) hacer pasar las células cultivadas en el espacio de cuatro días después de la extensión en placa, de modo que no exceda de una confluencia del 50%; y

f) hacer pasar las células cultivadas tratando las células cultivadas con solución salina.

2. Un cultivo de adhesión in vitro de células madre del sistema nervioso central de un mamífero, en donde el cultivo se puede obtener por el método de la reivindicación 1, y en donde las células madre

a) expresan nestina;

b) conservan la capacidad multipotencial de diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos; y

c) se diferencian tras la retirada de mitógeno.

3. Un método para la diferenciación de un cultivo in vitro de células madre del sistema nervioso central de un mamífero, en el que las células madre conservan la capacidad multipotencial de diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, que comprende las etapas de:

a) disociar células procedentes de tejido del sistema nervioso central mediante trituración mecánica en ausencia de cationes divalentes;

b) cultivar las células disociadas adheridas a una placa en un medio de cultivo exento de suero;

c) extender en placas células disociadas a una densidad que no exceda de 20.000 células/cm2 y, en pasos subsiguientes, volver a extender en placas las células cultivadas a una densidad que no exceda de 10.000 células/cm2;

d) añadir diariamente a las células cultivadas un primer factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en

i) bFGF a una concentración de al menos 10 ng/ml,

ii) EGF a una concentración de al menos 10 ng/ml,

iii) TGF-alfa a una concentración de al menos 10 mg/ml, y

iv) aFGF a una concentración de al menos 10 ng/ml más 1 μg/ml de heparina;

e) se hacen pasar las células cultivadas en el espacio de cuatro días después de la extensión en placa, de modo que no exceda de una confluencia del 50%;

f) se hacen pasar las células cultivadas tratando las células cultivadas con solución salina; y

g) separar el primer factor de crecimiento de las células cultivadas, en donde dicha separación da como resultado la diferenciación de las células cultivadas en neuronas, astrocitos y/u oligodendrocitos.

4. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en el que en la etapa (b) , el medio de cultivo se define químicamente, el medio de cultivo se reemplaza por medio reciente cada dos días y en el que en la etapa (f) la solución salina está exenta de cationes divalentes y las células se raspan de la placa.

5. El método o cultivo in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la células madre se derivan de tejido del sistema nervioso central de un ser humano.

6. El método o cultivo in vitro de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las células madre se derivan del tejido del sistema nervioso central de un feto no humano.

7. El método o cultivo in vitro de la reivindicación 5, en el que las células madre se derivan de tejido del sistema nervioso central de un adulto.

8. El método o cultivo in vitro de las reivindicaciones 5, 6 ó 7, en el que las células madre se derivan de tejido del sistema nervioso central seleccionado del grupo que consiste en hipocampo, corteza cerebral, cuerpo estriado, septum, diencéfalo, mesencéfalo, cerebelo y médula espinal.

9. El cultivo in vitro de la reivindicación 2, en el que las células madre se diferencian en neuronas maduras que exhiben:

a) una polaridad axón-dendrita,

b) terminales sinápticos, y

c) localización de proteínas implicadas en la sinaptogénesis y la actividad sináptica, que incluyen

i) receptores de neurotransmisores,

ii) transportadores, y

iii) enzimas de procesamiento.

10. El cultivo in vitro de la reivindicación 2, en el que las células madre conservan su capacidad de generar subtipos de neuronas con diferencias moleculares entre los subtipos.

11. El método de la reivindicación 3, que comprende, además, añadir un segundo factor de crecimiento a las células cultivadas después de separar el primer factor de crecimiento de las células cultivadas, en el que el segundo factor de crecimiento es diferente del primer factor de crecimiento.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el segundo factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor neurotrópico ciliar (CNTF) , factor inhibidor de leucemia (LIF) y hormona tiroides, yodotironina (T3) .