Método para aislamiento de polipéptidos solubles.

Un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 42

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10190225.

Solicitante: NATIONAL RESEARCH COUNCIL OF CANADA.

Nacionalidad solicitante: Canadá.

Dirección: 1200 MONTREAL ROAD, M-58, EG-06B OTTAWA, ONTARIO K1A 0R6 CANADA.

Inventor/es: TANHA,Jamshid.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/13 (Inmunoglobulinas)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/68 (en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > C07K16/00 (Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/10 (Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/12 (contra materiales bacterianos)

PDF original: ES-2546788_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Método para aislamiento de polipéptidos solubles Campo de la invención Esta invención se refiere al aislamiento, identificación y manipulación de polipéptidos, especialmente fragmentos monómeros de anticuerpos humanos. 5

Antecedentes de la invención Los anticuerpos en los vertebrados se componen típicamente de cadenas pesada (H) y ligera (L) apareadas. El primer dominio de las cadenas H y L combinadas, el VH y VL, son de secuencia más variable, y esta es la porción del anticuerpo que reconoce el antígeno y se fija al mismo. Los dominios VH y VL reconocen el antígeno como un par.

El repertorio inmunológico de los Camélidos (camellos, dromedarios y llamas) es único en el sentido de que posee 10 tipos raros de anticuerpos a los que se hace referencia como anticuerpos de cadena pesada (Hamers, Casterman C. et al., 1993) . Estos anticuerpos carecen de cadenas ligeras y por tanto sus sitios de combinación están constituidos por un solo dominio, denominado VHH.

Los anticuerpos VHH recombinantes de un solo dominio (sdAbs) proporcionan varias ventajas sobre los fragmentos FV monocatenarios (scFv) derivados de anticuerpos convencionales de cuatro cadenas. Si bien los sdAbs son 15 comparables a sus contrapartidas scFv en términos de afinidad, los mismos superan a los scFv en términos de solubilidad, estabilidad, resistencia a la agregación, susceptibilidad de replegado, rendimiento de expresión, y facilidad de manipulación del DNA, construcción de bibliotecas y determinaciones estructurales 3-D. muchas de las propiedades mencionadas de los scAbs VHH son deseables en aplicaciones que implican anticuerpos.

Sin embargo, la naturaleza no humana de los VHHs limita su uso en inmunoterapia humana debido a 20 inmunogenicidad. A este respecto, los sdAbs VH y VL humanos son candidatos ideales para aplicaciones de inmunoterapia debido a que se espera que sean menos inmunógenos.

Los VHs y VLs humanos, sin embargo, son por lo general tendentes a agregación, una característica común a los VHs y VLs derivados de anticuerpos convencionales (Davies, J. et al., 1994; Tanha, J. et al., 2001; Ward E.S. et al., 1989) . Por ello, se han realizado intentos para obtener VHs y VLs humanos adecuados para aplicaciones de 25 anticuerpos. Tales VHs y VLs han exhibido también otras propiedades útiles típicas de los VHHs tales como alto rendimiento de expresión, alta susceptibilidad de replegado y resistencia a la agregación. Bibliotecas sintéticas construidas a base de estos VHs y VLs como andamiajes de biblioteca podrían servir como una fuente prometedora de proteínas terapéuticas.

La camelización y la llamización, que implican incorporar residuos importantes de solubilidad de los VHHs de camello 30 y llama, respectivamente, en VHs o VLs humanos se han empleado para generar VHs y VLs humanos monómeros. Se ha demostrado que bibliotecas sintéticas de sdAb construidas sobre la base de estos VHs y VLs y generadas por aleatorización de la CDR son funcionales en términos de producción de ligantes para diversos antígenos (Davies, J. et al., 1995; Tanha J. et al., 2001) .

En otro enfoque, se aislaron VHs y VLs monómeros totalmente humanos de bibliotecas sintéticas humanas de VH y 35 VL sin recurrir a ingeniería de la clase arriba mencionada. En un experimento, se descubrió un VH humano monómero cuando una biblioteca de VH humano se lavó en batea contra lisozima de huevo de gallina (Jespers, L. et al., 2004b) . Más recientemente, un método de selección basado en criterios de desplegado reversible y afinidad produjo un gran número de VHs monómeros a partir de bibliotecas humanas sintéticas de VH (Jespers, L. et al., 2004a) . Este descubrimiento puso de manifiesto el hecho de que un método de selección apropiado es fundamental 40 para la captura eficiente de VHs humanos monómeros raros con propiedades biofísicas deseables.

Sumario de la invención La invención es el resultado de un método para aislamiento de polipéptidos, preferiblemente fragmentos de anticuerpo, y muy preferiblemente VHs y VLs con propiedades biofísicas deseables (solubilidad, estabilidad, expresión alta, monomericidad, no agregación, especifidad de fijación) . El método incluye las etapas de obtener una 45 biblioteca de presentación de fago capaz de expresar una diversidad de secuencias de polipéptidos, permitir la infección de un césped bacteriano por el fago de la biblioteca, e identificar fagos que forman calvas mayores que el tamaño medio en el césped bacteriano. Se aíslan luego los fagos, y se llevan a cabo etapas para secuenciar o caracterizar de otra forma las secuencias de polipéptidos.

La invención proporciona polipéptidos, especialmente VLs humanos monómeros, que pueden ser útiles para 50 inmunoterapia, y/o como agentes de diagnóstico o detección. Los VLs humanos monómeros pueden combinarse también para formar dímeros, trímeros, pentámeros u otros multímeros, que pueden ser útiles para inmunoterapia y/o como agentes de diagnóstico o detección.

Los polipéptidos identificados en esta invención, que incluyen VLs humanos, pueden manipularse por métodos tales como desordenamiento del DNA para seleccionar propiedades biofísicas mejoradas tales como solubilidad, estabilidad, monomericidad, expresabilidad alta, especificidad de fijación y origen humano.

Los polipéptidos identificados en esta invención, que incluyen VLs humanos, pueden utilizarse también para generar bibliotecas de presentación adicionales, que pueden utilizarse luego a su vez para aislar polipéptidos adicionales por 5 el método anterior.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un fragmento de anticuerpo VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42. 10

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método para producir polipéptidos con propiedades biofísicas deseables, que comprende las etapas de a) proporcionar una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2; b) proporcionar secuencias de oligonucleótidos con codones aleatorizados; c) incorporar los oligonucleótidos aleatorizados en la secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del 15 fragmento de anticuerpo, de tal modo que una o más de las CDRs está aleatorizada; y d) expresar las secuencias de nucleótidos producidas en la etapa (c) .

Descripción Detallada de los Dibujos Leyendas de las figuras Figura 1. Una representación gráfica de los resultados de ejemplos seleccionados: el contraste en el tamaño de 20 calva entre fagos que presentan un VH soluble (HVHP428) y aquéllos que presentan uno insoluble (BT32/A6) . La fotografía muestra una parte de la placa de agar de césped bacteriano que se amplió para mejorar la visualización de la calva. Aunque la placa contenía un número igual de cada uno de los dos tipos de calva, la fotografía contiene esencialmente las calvas HVHP428, de tamaño grande. La mayoría de las calvas BT32/A6 eran demasiado pequeñas para producir imágenes claras bien definidas en la fotografía. Por tanto, las calvas marcadas por flechas 25 representan una proporción menor de fagos BT32/A6 que eran lo suficientemente grandes para ser visibles en esta imagen. Los asteriscos marcan tamaños de calva representativos para los fagos HVHP428. Las identidades de las calvas se determinaron por secuenciación del DNA.

Figura 2. Secuencia de aminoácidos de los VHs humanos seleccionados sobre la base de la afinidad para la proteína A y el tamaño de la calva. Los puntos en las entradas de la secuencia... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 42.

2. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación, en donde el fragmento de anticuerpo es un VL.

3. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2.

4. Un multímero que comprende el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2. 5

5. Un dímero que comprende el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2..

6. Un trímero que comprende el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2.

7. Un pentámero que comprende el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2.

8. Un vector recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 3.

9. Una célula hospedadora transformada con el vector recombinante de la reivindicación 8. 10

10. Un método para producción de una biblioteca de fragmentos de anticuerpo, que comprende:

a) proporcionar una secuencia de nucleótidos que codifica el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2;

b) proporcionar secuencias de oligonucleótidos con codones aleatorizados;

c) incorporar los oligonucleótidos aleatorizados en la secuencia de nucleótidos que codifica una o más de 15 una de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del fragmento de anticuerpo, de tal modo que una o más de una de las CDR está aleatorizada; y d) expresar las secuencias de nucleótidos producidas en el paso c) .

11. Uso de una biblioteca de fragmentos de anticuerpos obtenida por el método de la reivindicación 10, para cribar las secuencias expresadas para fijación a un polipéptido diana. 20

12. El uso de la reivindicación 11, en donde el cribado comprende lavado en batea contra una molécula diana.