Método para aislamiento de polipéptidos solubles.

Un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 44

Detaiiada de ios Dibujos

Leyendas de ias figuras

Figura 1. Una representación gráfica de los resultados de ejemplos seleccionados: el contraste en el tamaño de calva entre fagos que presentan un VH soluble (HVHP428) y aquéllos que presentan uno insoluble (BT32/A6). La fotografía muestra una parte de la placa de agar de césped bacteriano que se amplió para mejorar la visuallzación de la calva. Aunque la placa contenía un número igual de cada uno de los dos tipos de calva, la fotografía contiene esencialmente las calvas HVHP428, de tamaño grande. La mayoría de las calvas BT32/A6 eran demasiado pequeñas para producir imágenes claras bien definidas en la fotografía. Por tanto, las calvas marcadas por flechas representan una proporción menor de fagos BT32/A6 que eran lo suficientemente grandes para ser visibles en esta imagen. Los asteriscos marcan tamaños de calva representativos para los fagos HVHP428. Las identidades de las calvas se determinaron por secuenciación del DNA.

Figura 2. Secuencia de aminoácidos de los VHS humanos seleccionados sobre la base de la afinidad para la proteína A y el tamaño de la calva. Los puntos en las entradas de la secuencia indican identidad de aminoácidos con HVHP2M10 o HVHP44. Se incluyen guiones para alineación de las secuencias. Los residuos en las posiciones de solubilidad principales y el residuo 57T que se asocia con VHS/VHHs con la propiedad de fijación de proteína A se muestran en negrilla. Se utiliza el sistema de numeración Kabat. El valor de la "frecuencia" total es 114

CDR = región determinante de la complementariedad; FR = región de entramado; gln seq = secuencia de la línea germinal

Figura 3. Tendencias de agregación de los VHS humanos. Cromatogramas de filtración en gel que comparan el estado de oligomerización de un VH humano aislado en este estudio (HVHP428) con el de un VnH de llama (H11C7) y un VH humano típico (BT32/A6). El pico que se eluye en último lugar en cada cromatograma corresponde al VH monómero. El pico H11C7 dímero está marcado por una flecha. B, espectros 1H NMR unidimensionales de HVHP414 a 800 MHz (i), HVHP423 a 500 MHz (¡i) y HVHP428 a 800 MHz (iii). Los espectros en el panel izquierdo están aumentados a escala con un factor de dos a fin de permitir una mejor observación de las señales de baja intensidad.

Figura 4. Estabilidad de los VHS humanos en términos de su resistencia a tripsina a 37°C y su integridad después de incubación larga a 37°C. A, SDS-PAGE que compara las movilidades del VH HVHP414 sin tratar y tratado con tripsina a los 15, 30 y 60 min con relación a un marcador de 21 kDa. HVHP414-cMyc denota VH de HVHP414 que carece del c-Myc. B, perfiles de masa molecular obtenidos por espectrometría de masas de VH de HVHP414 sin tratar y tratado con tripsina (60 min). El perfil de la espectrometría de masas del VH tratado se ha superpuesto al correspondiente al del VH sin tratar para proporcionar una mejor comparación visual. La masa molecular experimental del VH sin tratar es 14.967,6 Da, que es esencialmente idéntica a la masa molecular esperada, 14.967,7 Da. La masa molecular observada del VH tratado con tripsina (13.368,5 Da) indica la pérdida de 13 aminoácidos en el término C por escisión en K (Lys) en la etiqueta de c-Myc para dar una masa molecular esperada de 13368,0 Da. El sitio de escisión de tripsina se muestra por una flecha vertical encima de la secuencia de aminoácidos de HVHP414. C, cromatogramas de filtración en gel que comparan el estado de oligomerización del VH HVHP420 tratado a 37°C (perfil superior) con el del VH sin tratar (perfil inferior). Los cromatogramas se desplazaron verticalmente debido a que no podían distinguirse cuando estaban superpuestos. Los picos mayor y menor en cada cromatograma corresponden a VHS monómeros y dímeros, respectivamente. El VH dímero constituye 3% de la

proteína total. El recuadro muestra las superposiciones de sensogramas para la fijación de HVHP420 tratado a 37°C a la proteína A a diversas concentraciones. Los VHS utilizados para estudios de estabilidad térmica procedían de stocks que habían estado ya a 4°C durante vahos meses.

Figura 5. Superposiciones de sensogramas que muestran la fijación de HVHP423 nativo (líneas gruesas) y replegado (líneas delgadas) a la proteína A inmovilizada a concentraciones de 75, 100, 150 y 200 nM. Kof) y /<o/*ef se calcularon a partir de los sensogramas respectivos y se utilizaron para determinar RE como se describe más adelante.

Figura 6. Secuencias de aminoácidos de los V¡_s humanos seleccionados basadas en afinidad para la proteína L y tamaño de calva. Los puntos en las entradas de la secuencia indican identidad de aminoácidos con HVLP333. Se incluyen guiones para alineación de la secuencia. Véase la BASE V ( http://vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk/index.php?moduie=pagemaster&PAGE_user_op=v¡ew_page&

PAGE_¡d=7&MMN_position=5:5) para numeración de las secuencias y designación de la CDR. L6, A27, L2, L16, 02/012, A30 y 1b son designaciones de la línea germinal V. Las designaciones de la línea germinal J aparecen entre paréntesis. NF, no encontrado.

Figura 7. Cromatogramas de exclusión por tamaños de dominios V¡_ humanos. En A, se aplicaron los V¡_s a una concentración de 0,6 mg/ml. En B, se aplicaron los V¡_s a su máxima concentración disponible: HVLP342, 1,0 mg/ml; HVLP3103, 5,9 mg/ml; HVLP335, 4,9 mg/ml, HVLP351, 0,89 mg/ml. "#" y "*" representan picos agregados y monómeros, respectivamente. Los agregados se eluyen en el volumen de exclusión. El pico marcado por una fiecha en el panel HVLP342 (B) es el arrastre de una operación previa.

Figura 8. Superposiciones de sensogramas que muestran la fijación de V¡_s a la proteína L inmovilizada a concentraciones de 0,2, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 5 y 10 pM (HVLP389, HVLP351 y HVLP364); 1, 2, 3, 5, 7,5 y 10 nM (HVLP342); 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 5 y 10 pM (HVLP335); 0,2, 0,5, 1, 1,5, 2y 5 pM (HVLP325), 0,2, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3 y 5 pM (HVLP3103) y 1, 2, 3, 4, 5 y 6 nM (HVLP324). Los sensogramas para las fijaciones de HVLP324 y HVLP342 al sitio de baja afinidad de la proteína L no se incluyen, pero los KDs calculados se registran en la Tabla 3.

Figura 9. Fijaciones de HVHP328PTV2 a proteína A y HVLP335PTV2 a proteína L en experimentos de resonancia de plasmones de superficie. (A) Superposiciones de sensogramas que muestran la fijación de HVH28PTV2 a proteína A inmovilizada a concentraciones de 1, 2, 3, 4, 6, 8 y 10 nM. (B) Superposiciones de sensogramas que muestran la fijación de HVLP335PTV2 a proteína L inmovilizada a concentraciones de 1, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 y 4,5 nM. Los datos de fijación se registran en la Tabla 4.

Figura 10. Figura que muestra los resultados de los experimentos de microaglutinación con células de S. aureus. La concentración de los pentámeros decrece dos veces desde el pocilio 1 al pocilio 11, teniendo el pocilio 12 los pentámeros reemplazados con tampón de PBS. Los pocilios de la fila superior contienen pentámero de HVHP328PTV2 y los del fondo pentámero HVLP335PTV2. Las concentraciones de los pentámeros en los pocilios 1 a 6 son 215, 108, 54, 27, 13 y 7 pg/ml, respectivamente.

Descripción Detaiiada de ia invención

Es deseable identificar polipéptidos, especialmente fragmentos de anticuerpo, que son de origen humano, solubles, estables, resistentes a la agregación, replegables, que se expresan fuertemente, se manipulan fácilmente al nivel de DNA, son ideales para construcción de bibliotecas y para determinaciones estructurales 3-D. Tales fragmentos de anticuerpo son útiles para una gran diversidad de aplicaciones ¡nmunoterapéuticas, y también como agentes de diagnóstico y detección. Los anticuerpos monómeros VH y V¡_ presentan un interés particular, dado que es probable que tengan muchas de las propiedades arriba mencionadas.

Los polipéptidos con las propiedades arriba mencionadas pueden identificarse por cribado de alta capacidad de bibliotecas capaces de expresar una diversidad de secuencias de polipéptidos. Por ejemplo, pueden someterse a cribado bibliotecas de presentación de fago (preferiblemente fagos filamentosos tales como M13 o fd) por infección de un campo de bacterias sensible al fago (un césped bacteriano) con el fago, seguido por determinación de qué fagos han lisado con éxito las bacterias por búsqueda de áreas limpias, exentas de bacterias, conocidas como calvas. Los fagos que presentan VHS y V¡_s monómeros ¡laminados forman calvas mayores en céspedes bacterianos que los fagos que presentan VHS totalmente humanos con tendencias a agregación. Así pues, el tamaño de calva puede utilizarse como medio para identificar VHS y V¡_s monómeros raros existentes naturalmente a partir del repertorio de VH humano.

El... [Seguir leyendo]

1. Un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 44.

2. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el fragmento de anticuerpo es un V¡_.

3. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2.

4. Un multímero que comprende el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2.

5. Un dímero que comprende el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2.

6. Un trímero que comprende el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2.

7. Un pentámero que comprende el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2.

8. Un vector recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 3.

9. Una célula hospedadora transformada con el vector recombinante de la reivindicación 8.

10. Un método para producir una biblioteca de fragmentos de anticuerpo, que comprende:

a) proporcionar una secuencia de nucleótidos que codifica el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó

2;

b) proporcionar secuencias de oligonucleótidos con codones aleatorizados;

c) incorporar los oligonucleótidos aleatorizados en la secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del fragmento de anticuerpo, de tal modo que una o más de una de las CDRs está aleatorizada; y

d) expresar las secuencias de nucleótidos producidas en la etapa c).

11. Uso de una biblioteca de fragmentos de anticuerpo obtenida por el método de la reivindicación 10, para someter a cribado las secuencias expresadas para fijación a un polipéptido diana.

12. El uso de la reivindicación 11, en donde el cribado comprende lavado en batea contra una molécula diana.