Aislamiento y/o identificación de células madre con potencial de diferenciación adipocitario, condrocitario y pancreático.

Uso in vitro de un anticuerpo o fragmentos funcionales del anticuerpo,

que se une al antígeno TNAP, en combinación con un anticuerpo o fragmentos funcionales del anticuerpo, que se une a CD56, para el aislamiento de células madre con potencial de diferenciación adipocitario, condrocitario y pancreático.

Aislamiento y/o identificación de células madre con potencial de diferenciación adipocitario, condrocitario y

pancreático

La presente invención se refiere al aislamiento y/o la identificación de células madre con potencial de diferenciación adipocitario, condrocitario y pancreático, así como al uso de estas células madre.

Las células madre mesenquimatosas (MSC), también denominadas células estromales mesenquimatosas, son células multipotentes, que tienen la capacidad de diferenciarse, en condiciones adecuadas in vitro e in vivo, en distintos tejidos mesenquitamosos. De este modo pueden diferenciarse por ejemplo en osteocitos, condrocitos, adipocitos, miocitos, y formar tejido óseo, cartilaginoso, graso y muscular. Además, pueden diferenciarse también en astrocitos, neuronas, células endoteliales, hepatocitos, células de tipo pancreático y células epiteliales de pulmón. Morfológicamente pueden diferenciarse en su fenotipo fibroblastoide, y pueden encontrarse en distintos tejidos adultos y embrionarios del ser humano, entre ellos en el cerebro, médula ósea, sangre de cordón umbilical, en vasos sanguíneos, en el músculo esquelético, la piel, el hígado, las encías y la placenta.

Las MSC expresan una serie de marcadores de superficie tales como por ejemplo CD15 (endoglina, SH2), CD73 (ecto-S-nucleotidasa, SH3, SH4), CD166 (ALCAM), CD29 ((31-integrina), CD44 (H-CAM) y CD9 (Thy-1), que se encuentran en parte también en células endoteliales, epiteliales, así como en células musculares. Las MSC pueden diferenciarse también de las células madre hematopoyéticas, dado que las MSC no expresan los marcadores CD45, CD34 y CD133 específicos para células madre hematopoyéticas.

Las células madre mesenquimatosas tienen la propiedad de adherirse de manera rápida y estable sobre superficies de plástico o de vidrio, y de formar fibroblastos formadores de colonias (colony forming units" (unidades formadoras de colonias) (CFU-F)). Estos últimos son sin embargo heterogéneos con respecto a sus capacidades de proliferación y de diferenciación.

Las células madre mesenquimatosas con un potencial de diferenciación determinado son de gran interés en la medicina y en la investigación: pueden obtenerse en particular a partir de la médula ósea, incluso en aquellos seres humanos más mayores, tienen una alta tasa de participación y pueden diferenciarse tal como se mencionó en células de tejido de origen mesenquimatoso. Por lo tanto, por ejemplo en el contexto de terapias con células madre, pueden servir directamente para el tratamiento de enfermedades degenerativas de órganos tales como huesos, cartílagos, tendones, músculos, tejido conjuntivo, células sanguíneas, etc.

Para la obtención o el aislamiento de células madre mesenquimatosas se usan actualmente células de médula ósea no fraccionadas como material de partida, que se cultivan sobre cubetas de plástico, las MSC se identifican a través de su adhesión a la superficie de plástico, y las células hematopoyéticas no adheridas se eliminan de la muestra. Las células obtenidas de esta manera están sin embargo poco definidas y no se diferencian sólo en poblaciones de MSC heterogéneas, sino también en osteoblastos, y/o en células precursoras de osteoblastos, en células grasas, en células de retículo, en macrófagos y células endoteliales. Un tratamiento específico de enfermedades degenerativas de un órgano es por tanto difícil con MSC sin un potencial de diferenciación determinado o imposible debido a posibles efectos secundarios.

El aislamiento de células madre mesenquimatosas con un potencial de diferenciación muy determinado no es posible hasta el momento o se desconoce en el estado de la técnica. Un aislamiento de este tipo ofrecería sin embargo tal como se ha mencionado, la gran ventaja de que las células madre identificadas de esta manera podrían utilizarse de manera controlada para la terapia/el tratamiento de tejido enfermo, degenerado o dañado, en el que se diferencian las células madre aisladas específicamente de esta manera.

De este modo podrían tratarse por ejemplo daños en cartílago, porque se añaden células madre mesenquimatosas aisladas específicamente con potencial de diferenciación condrogénico o bien directamente in situ al tejido afectado, donde se diferencian para dar condrocitos, y de esta manera sustituyen al tejido dañado (terapia con células madre). Por otro lado, también una diferenciación en condrocitos in vitro puede ser de interés, cuando, por ejemplo para la investigación/el diagnóstico/la medicina deben obtenerse condrocitos diferenciados.

En este contexto existe un gran interés en células madre mesenquimatosas con un potencial de diferenciación determinado, en particular para utilizar las mismas en usos correspondientes.

Por lo tanto es objetivo de la presente invención proporcionar nuevas rutas con las que puedan aislarse células madre mesenquimatosas con un potencial de diferenciación determinado.

De acuerdo con la invención este objetivo se resuelve mediante el uso de un anticuerpo, que se une al antígeno TNAP (Tissue non-specific Alkaline Phosphatase\ fosfatasa alcalina no específica de tejido); en particular el objetivo se resuelve mediante el uso de un anticuerpo, o fragmentos funcionales del anticuerpo, que se une al antígeno

TNAP, en combinación con un anticuerpo, o fragmentos funcionales del anticuerpo, que se une a CD56, para el aislamiento de células madre con potencial de diferenciación adipocitario, condrocitario y pancreático.

El objetivo se resuelve así mismo mediante un procedimiento para el aislamiento y/o la diferenciación de células madre mesenquimatosas con potencial de diferenciación condrocitario, adipocitario o pancreático, en el que se utilizan los anticuerpos de unión frente a TNAP y frente a CD56.

Asi mismo la divulgación se refiere a las células madre aisladas de esta manera y a su uso, en particular en la terapia.

El objetivo en el que se basa la invención se resuelve de esta manera por completo. Los inventores de la presente solicitud pudieron mostrar en algunos ensayos que con el uso de los anticuerpos mencionados es posible aislar células madre mesenquimatosas de manera especifica, que a continuación se diferencian en condrocitos, adipocitos, o células de tipo pancreático.

Los inventores pudieron determinar en particular que las células madre mencionadas pueden aislarse y/o identificarse específicamente a través del antígeno TNAP. Esta isoforma de la ectoenzima fosfatasa alcalina se denomina debido a su existencia también como fosfatasa alcalina de higado/hueso/riñón. Las tres isoformas adicionales son fosfatasa alcalina de intestino, de placenta y de tipo placenta. La TNAP se diferencia de las otras isoformas por modificaciones postraduccionales y por la localización génica.

Por lo tanto se proporciona por primera vez una herramienta con la que pueden obtenerse células madre mesenquimatosas, que se diferencian de manera específica. Esto no era posible hasta el momento en el estado de

la técnica.

Es decir, debido al nuevo uso y al nuevo procedimiento pueden proporcionarse células madre mesenquimatosas, que por ejemplo pueden utilizarse a su vez de manera ventajosa en la terapia y la profilaxis pero también en el diagnóstico y la investigación. De este modo las células madre aisladas de esta manera pueden utilizarse en particular para el tratamiento de enfermedades que se caracterizan por un tejido degenerado, dañado o herido, por ejemplo en el contexto de una terapia con células madre: las células madre aisladas por medio del procedimiento de acuerdo con la invención se trasplantan para ello al tejido afectado (por ejemplo también en relación con implantes determinados), y se diferencian allí en el tejido correspondiente. Esta manera se regenera el tejido degenerado y vuelve a ser funcional de nuevo.

En un perfeccionamiento del uso de acuerdo con la invención se prefiere a este respecto cuando el anticuerpo anti- TNAP se selecciona del grupo:

el anticuerpo W8B2 que se produce por la línea celular con el número ACC 2567 depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,

fragmentos funcionales del anticuerpo W8B2, que se unen al antígeno TNAP, que se produce por la línea celular depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número ACC 2567,

y

un anticuerpo, que se une al mismo epítopo que el anticuerpo W8B2, que se produce por la línea celular depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número ACC 2567.

El anticuerpo W8B2 específico de TNAP ha dado buenos resultados en otros estudios como... [Seguir leyendo]

1. Uso in vitro de un anticuerpo o fragmentos funcionales del anticuerpo, que se une al antígeno TNAP, en combinación con un anticuerpo o fragmentos funcionales del anticuerpo, que se une a CD56, para el aislamiento de células madre con potencial de diferenciación adipocitario, condrocitario y pancreático.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el anticuerpo anti-TNAP se selecciona del grupo:

- el anticuerpo W8B2, que se produce por la línea celular depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número ACC 2567,

- fragmentos funcionales del anticuerpo W8B2, que se unen al antígeno TNAP, que se produce por la línea celular depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número ACC 2567, Y

- un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo W8B2, que se produce por la línea celular depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número ACC 2567.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado por que el anticuerpo de unión a CD56 se selecciona del grupo:

- el anticuerpo 39D5, que se produce por la línea celular depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número ACC 293,

- fragmentos funcionales del anticuerpo 39D5, que se unen a CD56, que se produce por la línea celular depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número ACC 293,

- un anticuerpo, que se une al mismo antígeno que el anticuerpo 39D5, que se produce por la línea celular depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número ACC 293, y

- un anticuerpo, que se une al mismo epítopo que el anticuerpo 39D5, que se produce por la línea celular depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número ACC 293.

4. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que además de la combinación de un anticuerpo anti-TNAP y un anticuerpo dirigido frente a CD56 se utiliza también un anticuerpo dirigido frente a CD271, o fragmentos funcionales del anticuerpo, que se unen a CD271.

5. Procedimiento para el aislamiento y/o la identificación de células madre mesenqulmatosas con potencial de diferenciación adipocitario, caracterizado por que presenta las siguientes etapas:

a) poner en contacto una muestra, que contiene células madre mesenqulmatosas, con un anticuerpo o con fragmentos funcionales del anticuerpo, que se une al antígeno TNAP,

b) poner en contacto la muestra de la etapa a) con un anticuerpo, que se une a CD56, o con fragmentos funcionales del anticuerpo, que se unen a CD56 y

c) aislar y/o identificar células, a las que se ha unido el anticuerpo o fragmentos funcionales del anticuerpo, que se une al antígeno TNAP, pero no el anticuerpo o fragmentos funcionales del anticuerpo, que se une a CD56.

6. Procedimiento para el aislamiento y/o la identificación de células madre mesenqulmatosas con potencial de diferenciación condrocitario, caracterizado por que presenta las siguientes etapas:

a) poner en contacto una muestra, que contiene células madre mesenqulmatosas, con un anticuerpo o con fragmentos funcionales del anticuerpo, que se une al antígeno TNAP,

b) poner en contacto la muestra de la etapa a) con un anticuerpo o con fragmentos funcionales del anticuerpo, que se une a CD56, y

c) aislar y/o identificar células, a las que se han unido tanto el anticuerpo o fragmentos funcionales del anticuerpo, que se une al antígeno TNAP, como el anticuerpo o fragmentos funcionales del anticuerpo, que se une a CD56.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por que presenta la etapa adicional c):

c) poner en contacto la muestra de la etapa b) con un anticuerpo o con fragmentos funcionales del anticuerpo, que se une a CD271.

8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado por que el anticuerpo anti-TNAP utilizado en la etapa a) se selecciona del grupo:

- el anticuerpo W8B2, que se produce por la línea celular de hlbrldoma depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número ACC 2567,

- fragmentos funcionales del anticuerpo W8B2, que se unen al antígeno TNAP y

- anticuerpos, que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo W8B2, que se produce por la línea celular de hibridoma depositada en la Deutsche Sammlung von Mlkroorganismen und Zellkulturen con el número ACC 2567.

9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizado por que el anticuerpo de unión a CD56 utilizado en la etapa b) se selecciona del grupo:

- el anticuerpo 39D5, que se produce por la línea celular de hibridoma depositada en la Deutsche Sammlung von Mlkroorganismen und Zellkulturen con el número ACC 293,

- fragmentos funcionales del anticuerpo 39D5, que se unen a CD56 y

- anticuerpos, que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo 39D5, que se produce por la línea celular de hibridoma depositada en la Deutsche Sammlung von Mlkroorganismen und Zellkulturen con el número ACC 293.

1. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 9, caracterizado por que las etapas a), b) y c) se llevan a cabo simultáneamente, de manera sucesiva o en orden inverso.

11. Células madre TNAP+ CD56+, que se aislaron y/o identificaron con un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 6y7u8o9o1 para la aplicación para la terapia o el diagnóstico.

12. Uso de células madre TNAP+ CD56+, que se aislaron y/o identificaron con un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 6y7 u8o9o1, para la generación definida de condrocitos y células de tipo pancreático.

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado por que las células madre TNAP+ CD56+, que se aislaron y/o identificaron con un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 a 1 y se diferenciaron en condrocitos y células de tipo pancreático, pueden utilizarse para la terapia y/o profilaxis.

14. Células madre TNAP+ CD56+, que se aislaron y/o identificaron con un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 6y7u8o9o1 para la aplicación para la terapia y/o profilaxis de daños, degeneraciones o enfermedades en cartílago, huesos, discos intervertebrales o para artritis reumatoide.

15. Composición farmacéutica, que presenta una combinación del anticuerpo W8B2 o fragmentos funcionales del anticuerpo W8B2, que se produce por la línea celular de hibridoma depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número ACC 2567, y del anticuerpo 39D5 o fragmentos funcionales del anticuerpo 39D5, que se produce por la línea celular de hibridoma depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número ACC 293.

16. Composición farmacéutica, que contiene células madre TNAP+ CD56+, que se aislaron y/o identificaron de acuerdo con el procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 y 7 u 8 o 9 o 1, así como al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente, sustancias terapéuticamente activas.

17. Kit, que contiene una combinación del anticuerpo W8B2 o fragmentos funcionales del anticuerpo W8B2, que se produce por la línea celular de hibridoma depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número ACC 2567, y del anticuerpo 39D5 o fragmentos funcionales del anticuerpo 39D5, que se produce por la línea celular de hibridoma depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número ACC 293.