Método de aislamiento de cuerpos apoptóticos.

Método de aislamiento de cuerpos apoptóticos.

La presente invención pertenece al campo del estudio de la apoptosis

, en particular al campo del pronóstico y monitorización de enfermedades que cursan con apoptosis. En concreto, se refiere a un método de aislamiento de cuerpos apoptótitos a partir de una muestra de fluido corporal y a métodos de pronóstico y de evaluación de la eficacia de un tratamiento de enfermedades vasculares, neurodegenerativas y/u oncológicas, basados en la utilización de dicho método de aislamiento de cuerpos apoptóticos.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201331688.

Solicitante: SEGURA MARTIN, Tomas.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: SEGURA MARTIN,Tomas, AYO MARTIN,Oscar, SERRANO DE LAS HERAS,Gema.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS... > A61P35/00 (Agentes antineoplásicos)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS... > A61P25/00 (Medicamentos para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS... > A61P9/00 (Medicamentos para el tratamiento de trastornos en el aparato cardiovascular)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/49 (de sangre)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/071 (Células o tejidos de vertebrados, p.ej. células o tejidos humanos)

PDF original: ES-2540255_A1.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Método de aislamiento de cuerpos apoptóticos Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de la apoptosis. En concreto, se refiere a un método para el aislamiento de cuerpos apoptóticos a partir de fluidos corporales y al uso de dicho método y cuerpos apoptóticos aislados para la evaluación de procesos apoptóticos, en particular en patologías como enfermedades vasculares, neurodegenerativas y oncológicas.

Antecedentes de la invención

La apoptosis es un tipo de muerte celular ordenada que depende de la puesta en marcha de una cascada de eventos moleculares que culminan en la total desintegración de la célula. En la etapa tardía del proceso apoptótico, y como consecuencia de la fragmentación celular, se generan pequeñas vesículas membranosas llamadas cuerpos apoptóticos.

En condiciones fisiológicas, la apoptosis participa en la morfogénesis y remodelación de tejidos durante el desarrollo, y en la regulación del sistema inmunológico y homeostasis. Sin embargo, dicho proceso juega también un papel fundamental en la muerte celular y tisular que tiene lugar en diversas patologías, tales como las enfermedades vasculares, enfermedades neurodegenerativas y enfermedades oncológicas. La evaluación de los procesos apoptóticos, en concreto la determinación del grado de apoptosis o índice apoptótico, en estas enfermedades sería muy útil en la práctica clínica diaria, dado que permitiría un pronóstico precoz y más exacto, una monitorización más efectiva de la evolución de la enfermedad, y la selección de los tratamientos más adecuados para cada paciente.

Sin embargo, el análisis in vivo de la apoptosis que se produce en los tejidos tiene una clara limitación ya que actualmente es necesario conseguir muestras histológicas de los pacientes mediante métodos intervencionistas, biopsia o cirugía. Por lo tanto, hay una necesidad sanitaria urgente de disponer de procedimientos no invasivos que permitan el estudio de la apoptosis, preferentemente de una manera rápida, sencilla y cuantitativa.

En el estado de la técnica pueden encontrarse un gran número de estudios que se centran

en la determinación de la muerte de un tejido, en particular mediante la obtención y análisis de muestras sólidas extraídas por métodos invasivos como biopsias (muestras de tejido). El grado de apoptósis se determina por diferentes técnicas conocidas por el experto en la materia, como son la detección de la fragmentación del ADN (técnica TUNEL, por ejemplo) y la detección de la fosfatidilserina presente en la parte externa de la membrana plasmática de las células apoptóticas con Anexina V. Sin embargo, en estos métodos las muestras de los pacientes se obtienen mediante métodos invasivos. Además en la mayoría de los casos se obtienen cultivos primarios de las biopsias y posteriormente se induce apoptosis para aislar cuerpos apoptóticos (WO 99/58645 A1), es decir, los cuerpos apoptóticos son aislados en condiciones no fisiológicas (inducción artificial de apoptosis).

Sorprendentemente, los autores de la presente invención han desarrollado un método para aislar mediante centrifugación cuerpos apoptóticos a partir de muestras de fluidos corporales. Es decir, dichos cuerpos apoptóticos están aislados en condiciones fisiológicas, sin inducción artificial previa de apoptosis. Asimismo, con dicho método se puede aislar hasta más de un 90% de la totalidad de cuerpos apoptóticos de la muestra de fluido corporal y además, los cuerpos apoptóticos mantienen su integridad, siendo por tanto detectables y cuantificables. En este sentido, el documento WO 03/076589 A2 describe métodos para detectar y analizar cuerpos apoptóticos de fluidos corporales. Entre los distintos métodos descritos, hay uno en el que se separan los cuerpos apoptóticos de la fracción celular mediante centrifugación. En una realización preferida, la muestra biológica es sangre y la misma se centrifuga a más de 500 g, de manera preferente entre 800 g y 1.200 g, quedando los cuerpos apoptóticos en la fracción de plasma. Si se desea separar o aislar dichos cuerpos apoptóticos del plasma, se lleva a cabo otra centrifugación a alta velocidad (no se define a cuál, para el experto en la materia en el campo de la presente invención, una alta velocidad correspondería a una velocidad mayor de 60.000 g), después de la cual los cuerpos apoptóticos quedan en el sedimento. Sin embargo, a diferencia de lo que se consigue con el método de la presente invención, con las condiciones descritas en WO 03/076589 no es posible aislar hasta un 90% de la totalidad de los cuerpos apoptóticos presentes en los fluidos corporales, ni mantener su integridad. Esto se debe, en primer lugar, a que la centrifugación a una velocidad mayor de 500 g para obtener el plasma o suero provoca la sedimentación de todos los componentes celulares de la sangre, entre los que se encuentran las plaquetas. Estas células tiene facilidad para formar agregados, especialmente en presencia de otro tipo de células sanguíneas, como son los hematíes y los leucocitos. Si esto tiene lugar, los cuerpos apoptóticos quedarían retenidos en los agregados celulares y la centrifugación a una velocidad mayor de 500 g provocaría su sedimentación

con la fracción celular, y por lo tanto, la pérdida de un gran número de ellos. Por otro lado, la centrifugación a alta velocidad del plasma o suero obtenido en la primera centrifugación, podría resultar en la ruptura de los cuerpos apoptóticos y en la contaminación de los mismos con otras vesículas membranosas de menor tamaño. Por estos inconvenientes, los cuerpos apoptóticos aislados según el método descrito en WO 03/076589 A2 tendrían poca o ninguna utilidad para el pronóstico y/o monitorización del tratamiento de sujetos con enfermedades asociadas a apoptosis, dado que el número de cuerpos apoptóticos aislados sería muy inferior al que realmente hay en el fluido corporal y los cuerpos apoptóticos podrían estar desintegrados y/o contaminados por otras microvesículas resultando en una cuantificación errónea de los cuerpos apoptóticos.

Sorprendentemente, los autores de la presente invención han desarrollado un método de aislamiento de cuerpos apoptóticos que mantienen su integridad y pueden ser por tanto cuantificados. Además, el método de la invención minimiza al máximo la pérdida de cuerpos apoptóticos durante su aislamiento llegándose a aislar hasta más del 90% de la totalidad de cuerpos apoptóticos presentes en la muestra de fluido corporal. De esta manera, los autores de la presente invención han desarrollado una herramienta de gran utilidad para el estudio clínico de la apoptosis. Así, la presente invención se refiere también a método de pronóstico basados en la cuantificación de cuerpos apoptóticos aislados siguiendo el método de la invención y al uso de dichos cuerpos apoptóticos como factor pronóstico y como marcador de la eficacia de un tratamiento terapéutico. Por último, otra importante ventaja de la integridad de los cuerpos apoptóticos aislados por el método de la presente invención es su uso para identificar el tipo celular de la célula que ha muerto por apoptosis, lo que proporciona una información de excepcional utilidad en el campo clínico, en particular, de enfermedades neurodegenerativas, vasculares y oncológicas.

Objeto de la invención

La presente invención se refiere en un primer aspecto a un método para el aislamiento de cuerpos apoptóticos (método de la invención) que comprende las siguientes etapas:

a) centrifugar una muestra de fluido corporal tomada de un sujeto, a una velocidad menor o igual a 300 g, y recoger el sobrenadante,

b) centrifugar el sobrenadante obtenido en la etapa a) a una velocidad entre 400 g y 1.000 g y recoger... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método de aislamiento de cuerpos apoptóticos a partir de una muestra de fluido corporal caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) centrifugar una muestra de fluido corporal tomada de un sujeto, a una velocidad menor o igual a 300 g, y recoger el sobrenadante,

b) centrifugar el sobrenadante obtenido en la etapa a) a una velocidad entre 400 g y 1.000 g y recoger el sobrenadante,

c) centrifugar el sobrenadante obtenido en la etapa b) a una velocidad entre 8.000 g y

40.000 g y eliminar el sobrenadante,

donde el sedimento obtenido en la etapa c) comprende los cuerpos apoptóticos aislados.

2. Método según la reivindicación 1, donde el fluido corporal se selecciona del grupo constituido por sangre, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido ascítico, líquido sinovial y líquido amniótico.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, donde el fluido corporal es sangre.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la velocidad de la etapa b) es de entre 500 g y 800 g.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la velocidad de la etapa c) es de entre 11.000 g y 30.000 g.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde entre las etapas a) y b) se lleva a cabo una etapa a1) en la que el sobrenadante obtenido en la etapa a) se diluye en un tampón.

7. Método de pronóstico de una enfermedad vascular caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

i) aislar cuerpos apoptóticos de una primera y una segunda muestra de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad vascular siguiendo el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la segunda muestra es tomada al menos 48 h después de la primera muestra,

ii) cuantificar los cuerpos apoptóticos aislados en la etapa i), y

iii) comparar el número de cuerpos apoptóticos aislados en las dos muestras, donde un mayor número de cuerpos apoptóticos en la segunda muestra que en la primera es indicativo de un mal pronóstico.

8. Método de determinación del estadio de una enfermedad neurodegenerativa caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

I) aislar cuerpos apoptóticos de una muestra de fluido corporal tomada de un paciente con una enfermedad neurodegenerativa siguiendo el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6,

II) cuantificar los cuerpos apoptóticos aislados en la etapa I), y

III) comparar el número de cuerpos apoptóticos aislados de la muestra con unos valores de referencia.

9. Método para analizar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad vascular caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

A) aislar cuerpos apoptóticos de dos muestras de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad vascular siguiendo el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde una primera muestra es tomada antes del tratamiento y una segunda muestra es tomada después del tratamiento, o donde las dos muestras son tomadas durante el tratamiento, una primera muestra una vez comenzado el tratamiento y una segunda muestra al menos 48 horas después de la primera,

B) cuantificar los cuerpos apoptóticos aislados en la etapa A), y

C) comparar el número de cuerpos apoptóticos en las dos muestras, donde un menor número de cuerpos apoptóticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz.

10. Método para analizar la eficacia de un tratamiento de una enfermedad oncológica y/o neurodegenerativa caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

A) aislar cuerpos apoptóticos de dos muestras de fluido corporal tomadas de un paciente con una enfermedad oncológica y/o neurodegenerativa siguiendo el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde una primera muestra es tomada antes del tratamiento y una segunda muestra es tomada después del tratamiento, o donde las dos muestras son tomadas durante el tratamiento, una primera muestra una vez comenzado el tratamiento y una segunda muestra al menos dos semanas después de la primera,

B) cuantificar los cuerpos apoptóticos aislados en la etapa A), y

C) comparar el número de cuerpos apoptóticos en las dos muestras, donde en la

enfermedad oncológica un mayor número de cuerpos apoptóticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz y en la enfermedad neurodegenerativa un menor número de cuerpos apoptóticos en la segunda muestra que en la primera indica que el tratamiento es eficaz.

11. Método para identificar el tipo de célula que ha muerto por apoptosis caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

1) aislar cuerpos apoptóticos de una muestra de fluido corporal siguiendo el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6,

2) detectar en la parte externa de la membrana plasmática del cuerpo apoptótico un

marcador de tipo celular.

12. Método según la reivindicación anterior, donde el marcador de tipo celular se selecciona del grupo constituido por CD90, GLAST, CD11b, CD100 y antígenos tumorales.

13. Uso del método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para pronóstico de una enfermedad vascular y/o neurodegenerativa.

14. Uso del método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para evaluar la 20 eficacia del tratamiento de una enfermedad oncológica, neurodegenerativa y/o vascular.

15. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para identificar el tipo celular de una célula que ha muerto por apoptósis.