Agente regenerador de tejido biológico y método para preparar y usar el mismo.

Un proceso para producir un agente regenerador de tejidos biológicos que comprende los pasos de:

(i) dejar que una primera muestra de sangre completa de un individuo coagule y se separe en coágulo y suero, desechando el coágulo y reservando el suero;

(ii) anticoagular una segunda muestra de sangre completa de dicho individuo con anticoagulante;

(iii) separar dicha segunda muestra en

una fracción celular que contiene principalmente glóbulos rojos y leucocitos, y

una fracción de plasma rico en plaquetas que comprende una pluralidad de plaquetas, y desechar la fracción celular;

(iv) someter dicha fracción de plasma rico en plaquetas de la segunda muestra a un tratamiento para inducir la lisis de las plaquetas en dicha fracción de plasma rico en plaquetas de la segunda muestra para formar una fracción de plasma rico en plaquetas que comprende plaquetas lisadas y fragmentos estructurales de plaquetas, dicho tratamiento comprende la adición de calcio a dicha fracción de plasma rico en plaquetas de la segunda muestra;

(v) combinar dicha fracción de plasma rico en plaquetas que comprende plaquetas lisadas y fragmentos estructurales de plaquetas, con el suero de dicha primera muestra que contiene alfa-2 macroglobulina, para formar una mezcla; y

(vi) eliminar todos los fragmentos estructurales de plaquetas de la mezcla para dar un agente regenerador de tejidos biológicos que comprende los materiales liberados por la lisis de plaquetas, en donde el TGF-ß está en una forma inactiva.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2005/029950.

Solicitante: GORROCHATEGUI BARRUETA, ALBERTO.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: Gorrochategui Barrueta,Alberto, Simon Elizundia,Josu, BARBERA-GUILLEM,EMILIO.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen sustancias... > A61K35/16 (Plasma sanguíneo; Suero sanguíneo (sangre del cordón umbilical A61K 35/51))

PDF original: ES-2529183_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Agente regenerador de tejido biológico y método para preparar y usar el mismo Campo técnico La presente invención se refiere al campo del crecimiento y reparación de tejidos biológicos, particularmente a un agente regenerador que aumenta el crecimiento, reparación y trasplante de tejidos y células, y un método para preparar y usar el mismo.

Antecedentes de la invención La lesión de tejido traumática o patológica produce pérdida de tejido biológico, seguido por intentos naturales en reparar y remodelar el tejido. Debido a fallos correspondientes en la reparación natural, la medicina humana y veterinaria intenta intervenir en el proceso de reparación y remodelado natural a través de un número de modalidades. Esto puede incluir la implantación de células diferenciadas en forma de trasplantes de órganos parciales o totales, sin embargo, esta modalidad está limitada por el suministro de tejidos compatibles, problemas de rechazo, y dificultades técnicas en el trasplante. Más recientemente, se ha llamado la atención sobre las posibilidades de implantar células madre multipotentes o pluripotentes para la regeneración de tejidos. Todas estas modalidades de introducción celular exógena están afectadas por lo que se puede llamar problema de interfase, en que están todas infestadas por problemas de angiogénesis lenta, inflamación, potencial infección, y cuestiones de rechazo inmunitario. Incluso la regeneración de tejido completamente natural es susceptible a algunos de estos problemas, lo que produce tiempo de curación extendido e incluso curación y regeneración tisular menos que óptima.

Un estimulante al proceso de regeneración de tejidos tanto natural como exógenamente asistida es el suministro de varios elementos que aceleran o asisten de otra manera en el proceso regenerativo. Al nivel más sencillo, un ejemplo es el suministro de matrices naturales y artificiales, tal como injertos de hueso; o el uso de agentes de unión de tejidos naturales y artificiales, tal como el uso del coágulo de fibrina o varios adhesivos tisulares artificiales. Tales materiales proporcionan una matriz física para que nuevas células crezcan sobre o soporta tejidos en proximidad durante el proceso de curación natural.

Alternativamente, se han propuesto varios estimulantes biológicos para el recrecimiento celular. Estos incluyen factores angiogénicos tal como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) tanto de preparaciones naturales como de fuentes recombinantes; y factores de crecimiento tisular, tal como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) , de nuevo tanto de preparaciones naturales como de fuentes recombinantes. También incluyen moduladores inmunitarios, que pueden incluir, entre otros; factor de crecimiento transformante recombinante (TGF-β) ; la aplicación de preparaciones de plasma o suero autólogas que incluyen moduladores inmunitarios naturales; o fármacos, tal como ciclosporina A. Crecientemente, se llama la atención sobre los denominados factores sinérgicos, un grupo mal entendido que incluye tales factores como antioxidantes, que se cree que ayudan en la regeneración e integración de nuevos tejidos.

Se sabe, o se cree, que todos estos compuestos existen en cantidades considerables en plaquetas. La contribución de varios factores derivados de plaquetas a la reparación de tejidos biológicos es bien conocida. Las plaquetas son los componentes corpusculares más pequeños de la sangre humana (diámetro 2-4 μm) , y su número fisiológico varía desde 150.000 a 300.000/mm3 en sangre humana normal. Las plaquetas no son verdaderas células, sino que son esencialmente fragmentos celulares formados sin material nuclear. El origen de las plaquetas es el megacariocito, una célula hematopoyética normalmente residente en la médula ósea. Los megacariocitos son células gigantes generadas tanto por el crecimiento mitótico de una célula progenitora comprometida, y la endorreduplicación de material genético de la célula sin división celular. Esta última modalidad de crecimiento celular produce células con núcleos poliploides y un gran citoplasma, en las que las membranas internas, mediante un proceso de división en parcelas, genera las proplaquetas o territorios de plaquetas. El megacariocito maduro, con el citoplasma segmentado en territorios de plaquetas, emite plaquetas como el producto final de protrusiones de su citoplasma a través de las paredes capilares. Las plaquetas contienen una variedad de orgánulos internos, tal como mitocondrias que suministran energía, cuerpos de golgi, y partículas de glucógeno; y un sistema citoesquelético microtubular y microfibilar; pero una de sus características más estudiadas es un sistema de gránulos α y cuerpos densos que constituyen los principales compartimentos de almacenamiento de las plaquetas.

Mientras que se han usado varias preparaciones de plasma que incluyen plaquetas enteras o fragmentadas para estimular la regeneración de tejidos, la presencia de sitios de histocompatibilidad en las membranas de las plaquetas y las cuestiones de histocompatibilidad resultantes han dirigido la atención a preparaciones de plaquetas purificadas, especialmente las de compuestos liberados de plaquetas intactas durante la activación de las plaquetas.

Una plaqueta en circulación posee aproximadamente 35 gránulos α y 5 cuerpos densos como principales compartimentos de almacenamiento. Los gránulos α contienen una serie de mediadores peptídicos; incluyendo las

quimioquinas factor de plaquetas 4 (PF-4) , b-tromboglobulina (b-TG) , quimioquinas reguladas tras la activación de células T normales expresadas y secretadas (RANTES) , y proteína inflamatoria de macrófagos 1α (MIP-1α) .

PF-4 y b-TG son mediadores de primera línea en el reclutamiento y activación de leucocitos. PF-4 muestra quimiotaxia para neutrófilos, monocitos, y fibroblastos. Induce la liberación de histamina de basófilos y estimula la adherencia de eosinófilos. Además, PF-4 previene la apoptosis de monocitos e inicia su diferenciación a macrófagos. Los neutrófilos son inducidos por PF-4 para adherirse al endotelio sin estimular y para liberar el contenido de sus gránulos secundarios. Las proteínas b-TG, que son productos proteolíticos de precursores inactivos, pueden actuar como agentes estimuladores o inhibidores en la activación de neutrófilos, dependiendo de su procesamiento.

La quimioquina RANTES induce la liberación de histamina de basófilos y la secreción de proteínas catiónicas de eosinófilos. Además, RANTES contribuye al reclutamiento inflamatorio o aterogénico de monocitos desde la circulación ya que se deposita en endotelio microvascular y arterial activado y desencadena parada de monocitos resistente a cizalla. MP-1α también tiene actividad liberadora de histamina sobre basófilos y muestra quimiotaxia para linfocitos T CD81.

A su vez, las quimioquinas, tal como RANTES y MP-1α, estimulan a las plaquetas para dar señales Ca21, para agregarse, y para liberar sus contenidos granulares. Tanto receptores funcionales, es decir, CCR1, CCR3 y CCR4; como de quimioquinas CXC (CXCR4) son detectables en plaquetas humanas.

La demostración de varios factores de crecimiento en los gránulos α ha sido particularmente importante. Las plaquetas almacenan grandes cantidades de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , que se libera tras la estimulación por trombina y agregación. VEGF fomenta la extravasación de proteínas de plasma, dirigiendo de esta manera la migración de leucocitos y células endoteliales y produciendo edema. VEGF también apoya la acumulación de líquido en heridas e inicia la angiogénesis en la fase de cicatrización. PDGF es... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un proceso para producir un agente regenerador de tejidos biológicos que comprende los pasos de:

(i) dejar que una primera muestra de sangre completa de un individuo coagule y se separe en coágulo y suero, desechando el coágulo y reservando el suero;

(ii) anticoagular una segunda muestra de sangre completa de dicho individuo con anticoagulante;

(iii) separar dicha segunda muestra en una fracción celular que contiene principalmente glóbulos rojos y leucocitos, y

una fracción de plasma rico en plaquetas que comprende una pluralidad de plaquetas, y desechar la fracción celular;

(iv) someter dicha fracción de plasma rico en plaquetas de la segunda muestra a un tratamiento para inducir la lisis de las plaquetas en dicha fracción de plasma rico en plaquetas de la segunda muestra para formar una fracción de plasma rico en plaquetas que comprende plaquetas lisadas y fragmentos estructurales de plaquetas, dicho tratamiento comprende la adición de calcio a dicha fracción de plasma rico en plaquetas de la segunda muestra;

(v) combinar dicha fracción de plasma rico en plaquetas que comprende plaquetas lisadas y fragmentos estructurales de plaquetas, con el suero de dicha primera muestra que contiene alfa-2 macroglobulina, para formar una mezcla; y

(vi) eliminar todos los fragmentos estructurales de plaquetas de la mezcla para dar un agente regenerador de tejidos biológicos que comprende los materiales liberados por la lisis de plaquetas, en donde el TGF-β está en una forma inactiva.

2. El proceso según la reivindicación 1, en donde el anticoagulante es citrato de calcio tamponado. 25

3. El proceso según la reivindicación 1, en donde el calcio se proporciona en forma de cloruro de calcio.

4. El proceso según la reivindicación 1, en donde productos normalmente encontrados secuestrados en

estructuras de plaquetas comprenden productos encontrados secuestrados en los gránulos alfa, y cuerpos 30 densos de una plaqueta intacta.

5. El proceso según la reivindicación 1, en donde el paso de eliminar todos los fragmentos de estructuras de plaquetas de la mezcla comprende además filtración a través de una membrana con poros menores que o iguales a 0, 4 μm.

6. El proceso según la reivindicación 1, que comprende además el paso de eliminar el TGF-β de dicha mezcla.

7. El proceso según la reivindicación 6, en donde el paso de eliminar el TGF-β del agente se logra añadiendo

decorina. 40

8. El proceso según la reivindicación 6, en donde el paso de eliminar el TGF-β del agente se logra pasando dicha mezcla a través de una columna de afinidad apropiada.

9. Un agente regenerador de tejidos biológicos para facilitar el crecimiento de tejidos obtenido según el proceso 45 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Un agente regenerador de tejidos biológicos según la reivindicación 9 para uso en el fomento de regeneración de tejidos.

11. Un agente regenerador de tejidos biológicos según la reivindicación 9 para uso en el fomento de cicatrización.

12. Un agente regenerador de tejidos biológicos según la reivindicación 9 para uso en el fomento de trasplante.

13. Una composición farmacéutica que comprende un agente regenerador de tejidos biológicos según la 55 reivindicación 9 y un excipiente farmacéuticamente aprobado.

Figura 1

Electroforesis en gel bidimensional (Estado de la técnica)

Figura 2

Electroforesis en gel bidimensional (Presente invención)

Efectos en células de piel Nueva Invención Estado de la técnica

Figura 3

Genes/rutas aumentados y disminuidos en células de piel Presente invención (Izquierda) ; Estado de la técnica (Derecha)

Efectos en células endoteliales Nueva Invención Estado de la técnica

Figura 4

Genes/rutas aumentados y disminuidos en células endoteliales Presente invención (Izquierda) ; Estado de la técnica (Derecha)

Efectos en fibroblastos Nueva Invención Estado de la técnica

Figura 5

Genes/rutas aumentados y disminuidos en fibroblastos Presente invención (Izquierda) ; Estado de la técnica (Derecha)

Efectos en macrófagos Nueva Invención Estado de la técnica

Figura 6

Genes/rutas aumentados y disminuidos en macrófagos Presente invención (Izquierda) ; Estado de la técnica (Derecha)

Figura 7

Estudio de elasticidad de la piel

Figura 8

Estudio de resistencia de la piel (Resistencia a la ruptura)

Figura 9

Crecimiento de células de la piel después de 96 horas de incubación A: Medio esencial mínimo suplementado con suero al 10%

B: Medio esencial mínimo suplementado con el 10% del compuesto regenerador de la presente invención

Figura 10