Una secuencia polinucleotídica purificada y aislada que codifica un polipéptido de fosfodiesterasa de nucleótido cíclico estimulada por GMP cíclico humano,

donde la secuencia polinucleotídica se selecciona del grupo que consiste en los insertos de ADN presentes en los vectores pGSPDE 6.1 (ATCC 68583), pGSPDE 7.1 (ATCC 68585) y pGSPDE 9.2 (ATCC 68584)

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a secuencias nucleotídicas novedosas, purificadas y aisladas, que codifican fosfodiesterasas estimuladas por GMP cíclico (cGS-PDEs) de humano. También se proveen los correspondientes productos de expresión recombinantes de dichas secuencias nucleotídicas, reactivos inmunológicos específicamente reactivos con las mismas y procedimientos para identificar compuestos que modulan la actividad enzimática de tales productos de expresión.

Se conocen nucleótidos cíclicos que median una amplia variedad de respuestas celulares frente a estímulos biológicos. Las nucleótido cíclico-fosfodiesterasas (PDEs) catalizan la hidrólisis de nucleótidos 3, 5 cíclicos, tales como el adenosín monofosfato cíclico (cAMP) y el guanosín monofosfato cíclico (cGMP), a sus correspondientes 5nucleótido monofosfatos y son, en consecuencia, importantes en el control de la concentración celular de los nucleótidos cíclicos. Las PDEs, a su vez, son reguladas por señales transmembrana o ligandos segundos mensajeros tales como el ion calcio (Ca2+)

o el cGMP. Las PDEs tienen, de este modo, un papel central en la regulación del flujo de información desde las hormonas extracelulares, los neurotransmisores u otras señales que utilizan a los nucleótidos cíclicos como mensajeros.

Las PDEs son un grupo grande y complejo de enzimas. Están distribuidas ampliamente en las células y tejidos de la mayoría de los organismos eucariotas pero se encuentran habitualmente presentes a nivel de trazas. Se han descripto por lo menos cinco familias diferentes de PDEs en base a características tales como la especificidad de sustrato, propiedades cinéticas, control regulatorio celular, tamaño y, en algunos casos, modulación por inhibidores selectivos. [Beavo, Adv. in Second Mess. And Prot. Phosph. Res. 22:1-38 (1988)]. Las cinco familias incluyen a:

I estimuladas por Ca2+/calmodulina II estimuladas por cGMP III inhibidas por cGMP IV específicas para cAMP V

específicas para cGMP

Dentro de cada familia existen múltiples formas de PDEs íntimamente relacionadas. Véase, Beavo, “Multiple Phosphodiesterase Isozymes Background, Nomenclature and Implications”, páginas 3-15; Wang et al., “Calmodulin-Stimulated Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases”, páginas 19-59; y Manganiello et al., “Cyclic GMP-Stimulates Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases”, páginas 62-85; todos en Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action, Beavo, J. and Houslay, M.D., Eds.; John Wiley & Sons, New York (1990).

Las PDEs dependientes de Ca2+/calmodulina (Cam-PDEs) se caracterizan por su respuesta al calcio intracelular, lo cual conduce a una concentración intracelular disminuida del cAMP y/o del cGMP. Una característica distintiva de las fosfodiesterasas estimuladas por cGMP (cGS-PDEs) es su capacidad de ser estimuladas por el cGMP para concretar la hidrólisis del cAMP.

Estudios in vitro han demostrado la actividad de PDE aumentada en respuesta al Ca2+/calmodulina en casi todos los tejidos de mamífero estudiados, como así también en Drosophila, Dictyostelium y tripanosomas. El nivel de CaM-PDE en tejidos y compartimientos celulares y subcelulares varía ampliamente. La mayoría de las células contienen al menos una pequeña proporción de actividad de Cam-PDE, encontrándose los niveles tisulares más altos en el cerebro, particularmente en las áreas sinápticas, Greenberg et al., Neuropharmacol., 17:737-745 (1978) y Kincaid et al., PNAS (USA), 84:1118-1122 (1987). Una disminución del cAMP en células de astrocitoma en respuesta a la estimulación muscarínica puede deberse a aumentos calcio-dependientes en la actividad de Cam-PDE. Tanner et al., Mol. Pharmacol., 29:455-460 (1986). También, la Cam-PDE puede ser una importante reguladora del cAMP en el tejido de la tiroides. Erneux et al., Mol. Cell Endocrinol., 43:123-134 (1985).

Los primeros estudios sugirieron que existen diferentes isoenzimas tejido-específicas de las CaM-PDEs. Varios miembros de la familia Cam-PDE se han descripto ahora, incluyendo una isoenzima de 59 kDa aislada de corazón bovino, e isoenzimas de 61 y 63 kDa aisladas de cerebro bovino. La Porte et al., Biochemistry, 18:2820-2825 (1979); Hansen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:2788-2792 (1982); véase también Sharma et al., J. Biol. Chem., 261:14160-14166 (1986). Las posibles contrapartidas de las isoenzimas bovinas de 59 y 61 kDa se han aislado también de tejidos de rata, Hansen et al., J. Biol. Chem., 261:14636-14645 (1986), sugiriendo que dos isoenzimas pueden expresarse en otras especies de mamíferos.

Además de criterios de peso molecular, otra evidencia apoya tanto similitudes como diferencias entre la familia CaM-PDE de isoenzimas. Por ejemplo, la isoenzima cardíaca de 59 kDa y la isoenzima cerebral de 61 kDa de Cam-PDEs difieren en movilidad en SDS-PAGE y en posición de elución en cromatografía DEAE y la isoenzima de 59 kDa tiene una afinidad por la calmodulina por lo menos 10-20 veces mayor. La oncomodulina, una oncoproteína fetal de unión al calcio presente en muy altas concentraciones en la placenta y en las células transformadas, también se une a la enzima de 59 kDa con una afinidad mayor que a la enzima de 61 kDa. Sin embargo, tanto la isoenzima cerebral de 61 kDa como la cardíaca de 59 kDa son reconocidas por un único anticuerpo monoclonal. Este anticuerpo se une al complejo Ca2+/CaM-PDE con una afinidad 100 veces mayor que a la PDE sola. Hansen et al., 1986, supra. Las isoenzimas de 59 y de 61 kDa tienen especificidades de sustrato y constantes cinéticas casi idénticas. Krinks et al., Adv. Cyc. Nucleotide Proteína. Phosphorylation Res., 16:31-47 (1984) han sugerido, en base a experimentos de mapeo de péptidos, que la proteína cardíaca de 59 kDa podría ser una forma proteolítica de la isoenzima cerebral de 61 kDa.

La isoenzima bovina cerebral de 63 kDa difiere sustancialmente de las isoenzimas de 59 y 61 kDa. La enzima de 63 kDa no es reconocida por el anticuerpo monoclonal que se une a las enzimas de 59 y 61 kDa. Hansen et al., 1986, supra. La proteína de 63 kDa no es fosforilada in vitro por la proteína quinasa cAMP-dependiente, mientras que la proteína de 61 kDa es fosforilada. Además, sólo la proteína de 61 kDa es fosforilada in vitro por la CaM-quinasa II. Sharma et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82:2603-2607 (1985); y Hashimoto et al., J.Biol. Chem., 264:10884-10887 (1989). Las isoenzimas de CaM-PDE de 61 y 63 kDa de cerebro bovino sí parecen, sin embargo tener afinidades de unión a CaM similares. Los mapas de péptidos generados por la proteólisis limitada con proteasa de Staphylococcus V8, Sharma et al., J.Biol. Chem., 259:9248 (1984), han sugerido que las proteínas de 61 y 63 kDa poseen diferentes secuencias de aminoácidos.

Se propone que las PDEs estimuladas por cGMP (cGMP-PDEs) tienen un sitio no catalítico específico para el cGMP que puede explicar la estimulación de la hidrólisis del cAMP por parte del cGMP. Stoop et al., J. Biol. Chem., 264:13718-(1989). A concentraciones de nucleótidos cíclicos fisiológicas, esta enzima responde a elevadas concentraciones de cGMP con una hidrólisis incrementada de cAMP. Así, la cGS-PDE permite que los aumentos en la concentración de cGMP moderen o inhiban las respuestas mediadas por cAMP. La secuencia primaria presentada recientemente en LeTrog et al., Biochemistry, 29:10280 (1990), con la co-autoría de los inventores de la presente, provee el armazón molecular para comprender las propiedades regulatorias y la subestructura de los dominios de esta enzima y para compararla con otras isoenzimas de PDE que responden a diferentes señales. Esta publicación también destaca la clonación de un fragmento de cADN de la corteza adrenal bovina de 2,2 kb, que codifica a cGS-PDE. Véase también Thompson et al., FASEB J., 5(6):A1592 (Resumen No. 7092), que informa acerca de la clonación de una “PDE Tipo II” de células de feocromocitoma de rata.

Con el descubrimiento del gran número de PDEs diferentes y su crítico papel en la señalización intracelular, los esfuerzos se han concentrado en hallar agentes que activen

o inhiban selectivamente isoenzimas PDE específicas. Los agentes que afectan la actividad celular de PDE, y de este modo alteran el cAMP celular, pueden utilizarse potencialmente para controlar una amplia gama de enfermedades y condiciones fisiológicas. Algunos fármacos que elevan los niveles de cAMP inhibiendo las PDEs están en uso, pero en general actúan como inhibidores...

1. Una secuencia polinucleotídica purificada y aislada que codifica un polipéptido de fosfodiesterasa de nucleótido cíclico estimulada por GMP cíclico humano, donde la secuencia polinucleotídica se selecciona del grupo que consiste en los insertos de ADN presentes en los vectores pGSPDE 6.1 (ATCC 68583), pGSPDE 7.1 (ATCC 68585) y pGSPDE 9.2 (ATCC 68584).

2. Una secuencia polinucleotídica purifica y aislada, que consiste en una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que tiene la actividad enzimática de una fosfodiesterasa de nucleótido cíclico estimulada por GMP cíclico humano, donde el polinucleótido codifica el mismo polipétido que los insertos de ADN humano en los vectores pGSPDE 6.1 (ATCC 68583), pGSPDE 7.1 (ATCC 68585) y pGSPDE 9.2 (ATCC 68584) mediante codones degenerados.

3. Una secuencia de ADN genómico de acuerdo con la reivindicación 1.

4. Un vector de ADN que tiene inserto en el mismo una secuencia de ADN, de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

5. Un método para transformar una célula huésped procariota o eucariota con la secuencia polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

6. Una célula huésped de levadura transformada establemente con un polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2.

7. Una célula huésped de E. Coli transformada establemente con un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

8. Un polipéptido codificado por la secuencia polinuleotídica de la reivindicación 1 ó 2.

9. Un anticuerpo que es específicamente inmunoreactivo con el polipéptido de la reivindicación 8.

10. Un método para producir un polipéptido que tiene la actividad enzimática de una fosfodiesterasa de nucleótido cíclico estimulada por GMP cíclico, comprendiendo dicho método:

(a) transformar o transfectar establemente una célula huésped procariota o eucariota con una secuencia polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2; y

(b) cultivar la célula huésped formada en el paso (a) en un medio nutriente en condiciones que permitan la expresión de dicha secuencia de ADN en dicha célula huésped.

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11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, que incluye además el paso de aislar el producto polipeptídico de expresión de dicha secuencia polinucleotídica en dicha célula huésped.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicha célula huésped es una célula huésped de levadura.

13. Un método de ensayo para identificar un agente químico que modifica la actividad enzimática de una fosfodiesterasa de nucleótido cíclico estimulada por GMP cíclico de mamífero, comprendiendo dicho método:

(a) transformar establemente, con una secuencia polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, una célula huésped procariota o eucariota que tenga un carácter fenotípico susceptible de alteración por expresión de dicha secuencia polinucleotídica en dicho huésped;

(b) cultivar la célula huésped formada en el paso (a) en un medio nutriente en condiciones que permitan la expresión de dicha secuencia polinucleotídica en dicha célula huésped acompañada de la correspondiente alteración en el fenotipo de la célula huésped;

(c) poner en contacto las células huésped cultivadas de acuerdo con el paso (b) con un agente químico a ensayar; y

(d) determinar cualquier modificación en la alteración del fenotipo de dichas células huésped puestas en contacto con dicho agente químico en el paso (c).

14. Un método de ensayo de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicha célula huésped es una célula huésped de levadura.

15. Un método de ensayo para identificar un agente químico que modifica la actividad enzimática de una fosfodiesterasa de nucleótido cíclico estimulada por GMP cíclico de mamífero, comprendiendo dicho método:

(a) transformar establemente, con una secuencia polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, una célula huésped procariota o eucariota que tenga un carácter fenotípico susceptible de alteración por expresión de dicha secuencia polinucleotídica en dicho huésped;

(b) cultivar la célula huésped formada en el paso (a) en un medio nutriente en condiciones que permitan la expresión de dicha secuencia polinucleotídica en dicho fenotipo de la célula huésped;

(c) identificar dichas células huésped que tengan un fenotipo alterado;

(d) fraccionar dicha célula huésped;

(e) aislar citosol de dicha célula huésped fraccionada;

(f) poner en contacto citosol con dicho dicho agente químico; y

(g) determinar si dicha actividad enzimática se ha alterado.

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16. Un método de ensayo de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicha célula huésped es una célula huésped de levadura.