Activación en solución de factor VII.

Un procedimiento para activar FVII a FVIIa en solución que comprende

(a) obtener una solución que comprende una preparación sustancialmente purificada de FVIImc;

(b) añadir a la solución un compuesto de amina, Ca2+ a una concentración final de aproximadamente 2 mM aaproximadamente 50 mM, y ajustar el pH final de la solución hasta aproximadamente un pH de 7,2 a 8,6;

(c) incubar la mezcla de activación resultante a entre aproximadamente 2ºC y aproximadamente 25ºC durante unperiodo de tiempo suficiente para convertir al menos un 90% de FVIImc en FVIIa; y

(d) opcionalmente, aislar el FVIIa de la mezcla de activación.

Activación en solución de factor VII

Campo de la invención La presente invención está dirigida a un procedimiento para la activación del factor VII a FVIIa en solución.

Antecedentes de la invención El factor VII (FVII) , una proteína importante en la cascada de coagulación sanguínea, es una proteína plasmática dependiente de vitamina K sintetizada en el hígado y secretada en la sangre en forma de una glucoproteína monocatenaria con un peso molecular de 53 kDa. El precursor de FVII (a veces designado como “FVII monocatenario” o FVIImc) se convierte en la forma activada (FVIIa) mediante escisión proteolítica en un solo sitio, R152-I153, dando como resultado dos cadenas ligadas por un solo puente disulfuro. El FVIIa humano recombinante está comercialmente disponible en Novo Nordisk con el nombre NovoSeven® y se usa para el tratamiento de episodios hemorrágicos, por ejemplo en hemofilia o traumatismo. Se han reseñado también variantes producidas recombinantemente de FVII humano.

La conversión del factor VII en factor VIIa activo puede conseguirse usando el factor XIIa como se describe por Hedner y Kisiel (J. Clin. Invest. 71: 1836-1841, 1983) , u otra proteasa que tenga especificidad de tipo tripsina (Kisiel y Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73: 29-42, 1983) .

La activación de FVII a FVIIa puede lograrse también sin el uso de proteasa añadida empleado el FVII mismo, que tiene actividad autoproteolítica a través de su dominio de serinproteasa. Dicha “autoactivación” se ha logrado poniendo en contacto FVII con una superficie o resina cargada positivamente, tal como una resina de intercambio aniónico (Pedersen A. H. et al. Biochemistr y 28: 9331-9336, 1989) . Cuando se efectúa, por ejemplo, en formato de columna, el FVIIa activo puede liberarse de la superficie o resina cargada positivamente, por ejemplo, aumentando la fuerza iónica, reduciendo el pH o aumentando la concentración de Ca2+ en el tampón (Bjoern et al., Research Disclosures 269: septiembre de 1986, pág. 564-565) .

Aunque el uso de una superficie o resina cargada positivamente para la activación de FVII a FVIIa (a veces designada como activación “en fase sólida” o “en columna”) evita el uso de proteasa o factor tisular añadido extrínsecamente, hay desventajas en dicho procedimiento. Puesto que la actividad proteasa de FVII intrínseca puede conducir también a la autodegradación de FVIIa, es esencial una monitorización cuidadosa de los parámetros de proceso críticos para limitar la formación de productos de degradación relacionados con el producto. Sin embargo, la activación que emplea una superficie o resina cargada positivamente, tal como a través de una columna de intercambio iónico, es altamente dependiente de una variedad de factores interdependientes que son difíciles de optimizar. Además, dichos procesos de activación en fase sólida o en columna no son susceptibles de un aumento de escala directo (por ejemplo, para fabricación) ni de una reducción de escala (por ejemplo, para optimización a pequeña escala y ensayo de parámetros múltiples) .

Existe la necesidad de un procedimiento eficaz, fiable y reproducible para activar FVII a FVIIa en solución sin el uso de proteasa, factor tisular ni fosfolípido extrínsecos, que sea susceptible de cambios de escala, se optimice fácilmente y conduzca a una calidad mejorada del producto proteico activado final. El procedimiento de activación en solución descrito en la presente memoria satisface esta necesidad.

Sumario de la invención Se han explorado las posibilidades de activar FVII a FVIIa en solución, es decir, sin poner en contacto el FVII con una superficie sólida tal como una resina de intercambio iónico para potenciar la activación, en ausencia de proteasa, factor tisular o fosfolípido añadido, y se ha encontrado sorprendentemente que se obtienen resultados excelentes usando este procedimiento de activación en solución.

Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para activar FVII a FVIIa en solución que comprende: obtener una solución que comprende una preparación sustancialmente purificada de FVIImc; añadir a la solución un compuesto de amina y Ca2+ a una concentración final de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM (tal como de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 30 mM) , y ajustar el pH final de la solución a aproximadamente 7, 2 a 8, 6 (tal como de aproximadamente 7, 6 a aproximadamente 8, 2) ; incubar la mezcla de activación resultante a entre aproximadamente 2ºC y aproximadamente 25ºC durante un periodo de tiempo suficiente para convertir al menos un 90% del FVIImc en FVIIa y, opcionalmente, aislar el FVIIa de la mezcla de activación. La solución que comprende la preparación sustancialmente purificada de FVIImc contiene, por ejemplo, al menos un 80% de FVIImc respecto a FVIIa u otros fragmentos derivados de FVII tal como, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95% o al menos un 98% de FVIImc respecto a FVIIa u otros fragmentos derivados de FVII.

En una realización, el compuesto de amina se selecciona de Tris, lisina, arginina, fosforilcolina o betaína. En algunos casos, el compuesto de amina se añade a una concentración final de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 500

mM (tal como de aproximadamente 100 mM) a la mezcla de activación. En algunos casos, se incluye un tampón tal como borato o HEPES para ajustar el pH de la mezcla de activación al pH deseado.

En una realización, la mezcla de activación tiene una concentración inicial de FVIImc de al menos 4 mg/ml tal como, por ejemplo, entre aproximadamente 4 mg/ml y 10 mg/ml. En otra realización, la mezcla de activación tiene una concentración inicial de FVIImc de aproximadamente 1 mg/ml a 4 mg/ml, y la mezcla de activación comprende adicionalmente un potenciador de la activación. Algunos de dichos potenciadores de la activación incluyen polietilenglicol, glicerol y etilenglicol tales como, por ejemplo, PEG4000, PEG8000 o glicerol. En algunos casos, está presente PEG4000 o PEG8000 a entre aproximadamente 1% y 10% (p/v) en la mezcla de activación tal como, por ejemplo, 5% de PEG4000 o 5% de PEG8000. En algunos casos, está presente glicerol o etilenglicol a entre aproximadamente 5% y 15% (v/v) en la mezcla de activación tal como, por ejemplo, 10% de glicerol o 10% de etilenglicol.

En otra realización, los componentes de la mezcla de activación se ajustan de tal modo que el periodo de tiempo suficiente para convertir al menos un 90% del FVIImc en FVIIa esté entre aproximadamente 4 horas y 24 horas a temperatura ambiente fría (por ejemplo, de aproximadamente 2 a 8ºC, tal como aproximadamente a 4ºC) o a temperatura ambiente (por ejemplo, de aproximadamente 18 a 25ºC, tal como aproximadamente a 20ºC o 22ºC) . En algunos casos, los componentes de la mezcla de activación se ajustan de tal modo que el periodo de tiempo suficiente para convertir al menos un 90% del FVIImc en FVIIa esté entre aproximadamente 8 horas y 24 horas a temperatura ambiente fría (de aproximadamente 2 a 8ºC, tal como aproximadamente a 4ºC) , tal como entre aproximadamente 8 horas y 16 horas.

En una realización, el FVII es una variante de FVII que difiere en 1-15 residuos aminoacídicos de la secuencia aminoacídica de FVII humano de tipo silvestre (SEQ ID NO:1) . En otra realización, la variante de FVII comprende las sustituciones P10Q o K32E. En otra realización, la variante de FVII comprende las sustituciones P10Q y K32E. En otra realización, la variante de FVII comprende las sustituciones P10Q, K32E, T106N y V253N.

En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para activar FVII a FVIIa en solución que comprende obtener una solución que comprende una preparación sustancialmente purificada de FVIImc; añadir Tris o lisina a la solución a una concentración final de aproximadamente 0, 1 M; añadir Ca2+ a una concentración final de aproximadamente 5 mM a 50 mM (tal como de aproximadamente 10 a 30 mM) ; ajustar el pH final de la solución a aproximadamente pH 8, en el que la concentración de FVIImc es de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml; incubar la mezcla de activación resultante a temperatura ambiente fría (por ejemplo, aproximadamente a 4ºC) durante de aproximadamente 8 horas a aproximadamente 24 horas (tal como de aproximadamente 8 horas a 16 horas) y, opcionalmente, aislar el FVIIa de la mezcla de activación.

En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para activar FVII a FVIIa en solución que comprende obtener una solución que comprende una preparación sustancialmente purificada de FVIImc; añadir Tris o lisina a la solución a una concentración... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para activar FVII a FVIIa en solución que comprende

(a) obtener una solución que comprende una preparación sustancialmente purificada de FVIImc;

(b) añadir a la solución un compuesto de amina, Ca2+ a una concentración final de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM, y ajustar el pH final de la solución hasta aproximadamente un pH de 7, 2 a 8, 6;

(c) incubar la mezcla de activación resultante a entre aproximadamente 2ºC y aproximadamente 25ºC durante un periodo de tiempo suficiente para convertir al menos un 90% de FVIImc en FVIIa; y

(d) opcionalmente, aislar el FVIIa de la mezcla de activación.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la solución que comprende la preparación sustancialmente purificada de FVIImc contiene al menos un 85% de FVIImc respecto a FVIIa y otros fragmentos derivados de FVII.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el compuesto de amina es Tris, lisina, arginina, fosforilcolina o betaína.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el compuesto de amina se añade a una concentración final de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 500 mM.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el pH final de la solución es de pH 7, 6 a 8, 2.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el pH final de la solución es de aproximadamente pH 8.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la mezcla de activación tiene una concentración inicial de FVIImc de al menos 4 mg/ml.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la mezcla de activación tiene una concentración inicial de FVIImc de aproximadamente 1 mg/ml a 4 mg/ml, y la mezcla de activación comprende adicionalmente un potenciador de la activación.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el potenciador de la activación es polietilenglicol, glicerol o etilenglicol.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el potenciador de la activación es PEG4000, PEG8000 o glicerol.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el periodo de tiempo suficiente para convertir al menos un 90% de FVIImc en FVIIa es entre aproximadamente 4 horas y 24 horas.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la mezcla de activación tiene una concentración inicial de FVIImc de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, el compuesto de amina es Tris o lisina a una concentración final de aproximadamente 0, 1 M, la concentración de Ca2+ es de 10 mM a 30 mM, el pH de la mezcla de activación es aproximadamente pH 8 y la solución se incuba a aproximadamente 4ºC durante 8-24 horas.

13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el FVII es una variante de FVII que difiere en 1-15 residuos aminoacídicos de la secuencia aminoacídica de FVII humano (SEQ ID NO:1) .

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la variante de FVII comprende las sustituciones P10Q y K32E.