Acoplamiento de polipéptidos en el extremo C-terminal.

Un método para acoplar entre sí dos polipéptidos diferentes en sus respectivos extremos C-terminales que comprende

(a) una modificación catalizada enzimáticamente de los extremos C-terminales de los polipéptidos que se van a acoplar mediante la cual un grupo químico que comprende un grupo reactivo W se introduce en el extremo C-terminal del primer polipéptido que se va a acoplar y un grupo químico que comprende un grupo reactivo Z se introduce en el extremo C-terminal del segundo polipéptido que se va a acoplar, y

(b) hacer reaccionar

el grupo reactivo Z con un grupo reactivo Y de una molécula espaciadora para formar un grupo químico X y hacer reaccionar el grupo reactivo W con un grupo reactivo V de la molécula espaciadora para formar un grupo químico U, en donde el espaciador entre los dos polipéptidos comprende al menos un dirradical etilenglicol, en el que X y U se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en dirradicales oxima y triazol, en donde V, W, Y y Z se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en alcoxilamino, oxo, azido y alquinilo

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2007/051388.

Solicitante: NOVO NORDISK HEALTH CARE AG.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: Thurgauerstrasse 36/38 8050 Zürich SUIZA.

Inventor/es: PESCHKE, BERND, ZUNDEL,MAGALI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales caracterizadas por los... > A61K47/48 (estando el ingrediente no activo químicamente unido al ingrediente activo, p. ej. conjugados polímero-medicamento)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/61 (Hormona del crecimiento (GH) (Somatotropina))

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Fragmento de la descripción:

Acoplamiento de polipéptidos en el extremo C-terminal

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de la química de proteínas, en particular, a conjugados de polipéptidos terapéuticos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Una gama de polipéptidos de origen humano se han utilizado como agentes terapéuticos para el tratamiento de diversas enfermedades en los últimos 80 años. Diferentes modificaciones de polipéptidos naturales también se han sometido a ensayo con el fin de aumentar la potencia o para remediar diferentes inconvenientes del polipéptido natural cuando se utilizaba como agente terapéutico, por ejemplo, debido a una tasa de aclaramiento demasiado elevada. Dentro del campo de los polipéptidos terapéuticos, se ha investigado entre otras cosas, si el acoplamiento de dos polipéptidos entre sí puede conferir efectos farmacodinámicos o farmacocinéticos beneficiosos. Por lo general, estos conjugados de polipéptidos han sido compuestos dimerizados o polipéptidos de fusión conectados a través de un enlace peptídico entre el extremo C-terminal del primer polipéptido y el extremo N-terminal del segundo polipéptido.

Ejemplos de efectos biológicos modificados o mejorados de polipéptidos dimerizados en comparación con los polipéptidos monómeros se pueden encontrar en la bibliografía.

Albrecht et al. (Bioconjugate Chem. 15, 16-26 (2004) ) dimerizaron ScFvs a través de un enlace ditio.

Gao et al. (Bioorg. Med. Chem. Lett. 15, 1847-1850 (2005) ) describen la relación entre la estructura y la actividad de nuevos análogos bivalentes y modificados en el extremo C-terminal de endomorfina-2. Al parecer se obtuvo una potencia diez veces más alta mediante la dimerización del extremo C-terminal de este polipéptido. La dimerización del extremo C-terminal se logró mediante el uso de diaminas simétricas a las que se habían acoplado los polipéptidos. Esta estrategia se puede utilizar para péptidos de tamaño limitado accesibles de forma sintética. Sin embargo, para polipéptidos más grandes producidos en un sistema biológico, esta estrategia no sería útil ya que se espera que un acoplamiento selectivo de una diamina con el extremo C-terminal será muy complicado, ya que requeriría una activación selectiva del ácido del extremo C-terminal.

Stewart (Peptides 25, 527-532 (2004) ) informó sobre un efecto de dimerización pronunciado en el extremo Nterminal de un polipéptido sobre la actividad biológica. Aunque el propio péptido no mostró ningún efecto sobre la inhibición del crecimiento in vivo de una línea celular cancerígena PC-3, la versión dimerizada mostró una inhibición del 78%.

Las moléculas bifuncionales que se han utilizado como espaciadores para la conjugación covalente de dos biomoléculas, han sido descritas por Li et al. (Bioorg. Med. Chem. Lett. 15, 5558-5561 (2005) ) .

El documento EP 243 929 describe ciertos usos de la carboxipeptidasa para incorporar polipéptidos, grupos informadores o agentes citotóxicos en el extremo C-terminal de polipéptidos.

Una modificación covalente, por ejemplo, mediante PEGilación o fijación de lípidos, se ha aplicado con éxito en varios productos farmacéuticos basados en polipéptidos, para mejorar sus perfiles farmacocinéticos y farmacodinámicos. En la práctica, sin embargo, esta metodología no siempre garantiza compuestos polipeptídicos con la combinación óptima de perfiles farmacocinéticos y farmacodinámicos, es decir, actividad elevada, semivida circulatoria prolongada, etc. Además, los métodos disponibles para el acoplamiento de dos polipéptidos limitan el número de conjugados polipeptídicos que se han sintetizado y sometido a ensayos preclínicos y clínicos. Por ejemplo, muchos polipéptidos que pueden ser útiles como agentes terapéuticos, pueden presentar una actividad biológica que está influenciada por modificaciones en el extremo N-terminal. Para tales polipéptidos puede ser difícil producir conjugados de polipéptidos, ya que un acoplamiento a través del extremo N-terminal pone en peligro la actividad biológica deseada. Los aspectos de seguridad, la legislación reguladora y los costes de fabricación, todos ellos exigen que los métodos para el acoplamiento de dos polipéptidos que se van a utilizar como un producto farmacéutico; y en particular como un compuesto terapéutico, puedan producir el conjugado de polipéptido de una forma razonable pura a partir de los polipéptidos constituyentes.

Por lo tanto, existe una necesidad de métodos mejorados y alternativos para acoplar polipéptidos para producir conjugados de polipéptidos que se puedan obtener con rendimientos comercialmente pertinentes, que muestren una actividad específica elevada, una semivida plasmática prolongada y/o propiedades físicoquímicas aceptables en relación con la fabricación, la manipulación y la formulación. Tales métodos se proporcionan junto con aspectos adicionales, características y ventajas de la invención descrita en la descripción de la invención proporcionada en el presente documento. Estos aspectos se describen más detalladamente junto con aspectos adicionales, características y ventajas de la invención que serán evidentes a partir de la descripción de la invención proporcionada en el presente documento.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Puede ser ventajoso el acoplamiento de polipéptidos entre sí con el fin de mejorar, por ejemplo, su actividad biológica cuando dos polipéptidos del mismo tipo están muy próximos uno del otro, para combinar dos efectos biológicos diferentes cuando dos polipéptidos diferentes se acoplan entre sí, y/o para mejorar los parámetros farmacocinéticos de al menos uno de los polipéptidos acoplados.

La presente invención proporciona, entre otras cosas, un método para acoplar dos polipéptidos entre sí en sus respectivos extremos C-terminales, que comprende la modificación de los extremos C-terminales y hacer reaccionar los extremos C-terminales para formar un enlace covalente entre los dos polipéptidos.

Este método muestra que es útil para producir conjugados de polipéptidos con rendimientos y pureza elevados, así como para permitir que ambos polipéptidos constituyentes conserven sus extremos N-terminales intactos.

En particular, la presente invención proporciona un método para el acoplamiento de dos polipéptidos entre sí, a través de sus respectivos extremos C-terminales que comprende

(a) una modificación catalizada enzimáticamente de los extremos C-terminales de los polipéptidos que se van a acoplar, según la cual grupos químicos que comprenden grupos reactivos se introducen en los extremos Cterminales de los polipéptidos que se van a acoplar, y

(b) hacer reaccionar

(i) los grupos reactivos de los dos grupos químicos entre sí o

(ii) hacer reaccionar el grupo reactivo del primer grupo químico con un primer grupo reactivo de una molécula espaciadora y hacer reaccionar el grupo reactivo del segundo grupo químico con un segundo grupo reactivo de la molécula espaciadora, en donde el espaciador entre los dos polipéptidos comprende al menos un dirradical etilenglicol.

Más específicamente, la presente invención proporciona un método que comprende

(a) una modificación catalizada enzimáticamente de los extremos C-terminales de los polipéptidos que se van a acoplar mediante la cual un grupo químico que comprende un grupo reactivo W se introduce en el extremo C-terminal del primer polipéptido que se va a acoplar y un grupo químico que comprende un grupo reactivo Z se introduce en el extremo C-terminal del segundo polipéptido que se va a acoplar, y

(b) hacer reaccionar el grupo reactivo Z con un grupo reactivo Y de una molécula... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para acoplar entre sí dos polipéptidos diferentes en sus respectivos extremos C-terminales que comprende (a) una modificación catalizada enzimáticamente de los extremos C-terminales de los polipéptidos que se van a acoplar mediante la cual un grupo químico que comprende un grupo reactivo W se introduce en el extremo C-terminal del primer polipéptido que se va a acoplar y un grupo químico que comprende un grupo reactivo Z se introduce en el extremo C-terminal del segundo polipéptido que se va a acoplar, y

(b) hacer reaccionar

el grupo reactivo Z con un grupo reactivo Y de una molécula espaciadora para formar un grupo químico X y

hacer reaccionar el grupo reactivo W con un grupo reactivo V de la molécula espaciadora para formar un grupo químico U, en donde el espaciador entre los dos polipéptidos comprende al menos un dirradical etilenglicol, en el que X y U se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en dirradicales oxima y triazol, en donde V, W, Y y Z se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en alcoxilamino, oxo, azido y alquinilo.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que la enzima es carboxipeptidasa Y o una variante o un fragmento de la misma, en donde la variante o el fragmento conserva la capacidad para catalizar una reacción, a través de la cual se sustituye el aminoácido C-terminal de una proteína o péptido por un resto químico diferente.

3. Un método según la reivindicación 2, en el que la enzima es carboxipeptidasa Y.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que al menos uno de los polipéptidos 20 es la hormona de crecimiento humana.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que al menos uno de los polipéptidos es un derivado de la hormona de crecimiento humana.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que al menos uno de los polipéptidos

es una variante de la hormona de crecimiento humana o un derivado de una variante de la hormona de crecimiento 25 humana.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que al menos uno de los polipéptidos es hGH-Leu-Ala.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el grupo químico Z se introduce a través de un enlazador A.

9. Un método según la reivindicación 8, en el que el enlazador A se selecciona a partir del grupo que consiste en birradicales de alcano C1-10, alqueno C2-10, alquino C2-10, heteroalcano C1-10, heteroalqueno C2-10, heteroalquino C2-10 lineales, ramificados y/o cíclicos, en donde cualquiera de ellos puede estar sustituido con oxo, en donde se puede insertar uno o varios birradicales de compuestos aromáticos homocíclicos o birradicales de compuestos aromáticos heterocíclicos.

10. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el grupo químico W se introduce a través de un enlazador B.

11. Un método según la reivindicación 10, en el que el enlazador B se selecciona a partir del grupo que consiste en birradicales de alcano C1-10, alqueno C2-10, alquino C2-10, heteroalcano C1-10, heteroalqueno C2-10, heteroalquino C2-10 lineales, ramificados y/o cíclicos, que puede estar sustituido opcionalmente con oxo, en donde se puede inser

tar uno o varios birradicales de compuestos aromáticos homocíclicos o birradicales de compuestos aromáticos heterocíclicos.

12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que enlazador A y el enlazador B se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en

y

13. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el resto que enlaza los dos polipéptidos en el producto final comprende un resto 1, 2, 3-triazol.