Métodos y ácidos nucleicos para el análisis de trastornos proliferativos de células colorrectales.

Un método para detectar cáncer de colon en un sujeto que comprende:

i) poner en contacto el ADN genómico aislado de plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre obtenida del sujeto con al menos un reactivo, o serie de reactivos que distingue entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos una región objetivo del ADN genómico, en donde dicha región objetivo comprende, o se hibrida en condiciones rigurosas con al menos 16 nucleótidos contiguos del gen o la secuencia de ALX4; y

ii) detectar el cáncer de colon en un sujeto con base en el estado de metilación de al menos una secuencia del dinucleótido CpG objetivo, o un promedio, o un valor que refleja un estado de metilación promedio de una pluralidad de secuencias del dinucleótido CpG objetivo en dicha región objetivo.

Métodos y ácidos nucleicos para el análisis de trastornos proliferativos de células colorrectales Campo de la invención La presente invención se refiere a secuencias de ADN genómico que exhiben patrones de metilación alterados de CpG en estados de enfermedad con respecto a la normalidad. Realizaciones particulares proporcionan métodos, ácidos nucleicos, matrices de ácidos nucleicos y kits útiles para detectar, o para detectar y diferenciar entre dos o más trastornos proliferativos de células colorrectales.

Antecedentes Se sabe que la etiología de estados patógenos involucra patrones de metilación modificados de genes individuales o del genoma. La 5-metilcitosina, en el contexto de secuencias de dinucleótido CpG, es la base modificada covalentemente más frecuente en el ADN de las células eucariotas, y desempeña un papel en la regulación de la transcripción, la impronta genética, y la tumorigénesis. La identificación y cuantificación de los sitios 5-metilcitosina en un espécimen específico, o entre dos o más de una pluralidad de especímenes, es por tanto de considerable interés, no sólo en la investigación, sino en particular para los diagnósticos moleculares de diversas enfermedades.

Correlación de la metilación aberrante del ADN con el cáncer. La metilación aberrante del ADN dentro de 'islas' CpG se caracteriza por híper o hipometilación de secuencias de dinucleótidos CpG que conduce a la anulación o la sobreexpresión de un amplio espectro de genes, y es una de las primeras y más comunes alteraciones encontradas, y correlacionadas con tumores malignos humanos. Además, se ha demostrado que la metilación anormal se produce en los elementos reguladores ricos en CpG en partes intrónicas y codificantes de los genes para determinados tumores. En el cáncer de colon, por ejemplo, la metilación aberrante del ADN constituye uno de las alteraciones más destacadas e inactiva muchos genes supresores de tumores tales como p14ARF, p16INK4a, THBS1, MINT2 y MINT31 y genes reparadores de la falta de correlación del ADN como hMLH1.

En contraste con la hipermetilación específica de genes supresores de tumores, se puede observar una hipometilación total del ADN en las células tumorales. Esta disminución en la metilación global puede ser detectada tempranamente, mucho antes del desarrollo de la formación franca de tumores. Se ha determinado una correlación entre la hipometilación y el aumento de la expresión génica para muchos oncogenes.

En los Estados Unidos, la incidencia anual de cáncer colorrectal es de aproximadamente 150.000, con 56.600 individuos que mueren por cáncer colorrectal cada año. El riesgo de por vida de cáncer colorrectal en la población general es de aproximadamente de 5 a 6 por ciento. A pesar de los intensos esfuerzos de los últimos años en el cribado y la detección temprana de cáncer de colon, hasta hoy en día la mayoría de los casos son diagnosticados en una etapa avanzada con metástasis regional o distante. Aunque las opciones terapéuticas incluyen cirugía y quimioterapia adyuvante o paliativa, la mayoría de los pacientes mueren a causa del avance de su cáncer a los pocos meses. Identificar los cambios moleculares que subyacen en el desarrollo del cáncer de colon pueden ayudar a desarrollar nuevas opciones de control, detección, diagnóstico y terapéuticas que podrían mejorar el mal pronóstico global de estos pacientes.

Las directrices actuales para detección colorrectal de acuerdo con la Sociedad Americana del Cáncer utiliza una de las cinco diferentes opciones para la detección en individuos de riesgo promedio de 50 años de edad o mayores. Estas opciones incluyen 1) pruebas de sangre oculta en las heces (FOBT) cada año, 2) sigmoidoscopia flexible cada cinco años, 3) FPBT anual más sigmoidoscopia flexible cada cinco años, 4) el enema de bario de doble contraste (DCBE) cada cinco años o 5) colonoscopia cada diez años. Aunque estos procedimientos de análisis son bien aceptados por la comunidad médica, la implementación de la detección generalizada del cáncer colorrectal no se ha realizado. La conformidad del paciente es un factor importante para un uso limitado debido a la incomodidad o inconveniencia asociada con los procedimientos. La prueba FOBT, aunque no es un procedimiento invasivo, requiere de una restricción en la dieta y otras restricciones 3-5 días antes de la prueba. Los niveles de sensibilidad de este análisis también son muy bajos para el adenocarcinoma colorrectal con gran variabilidad dependiendo del ensayo. Las mediciones de sensibilidad para la detección de adenomas es incluso menor ya que la mayoría de los adenomas no sangran. En contraste, la sensibilidad para los procedimientos más invasivos como la sigmoidoscopia y la colonoscopia es bastante más alta debido a la visualización directa del canal central del colon. Ninguno de los ensayos aleatorios han evaluado la eficacia de estas técnicas, sin embargo, a partir de los datos de los estudios de control de casos y datos del Estudio Nacional de Pólipos (US) se ha demostrado que la eliminación de pólipos adenomatosos resulta en una reducción del 76-90% en la incidencia de CRC. La sigmoidoscopia tiene la limitación de visualizar solamente el lado izquierdo del colon dejando las lesiones en el colon derecho sin detectar. Ambos procedimientos de detección son costosos, requieren de una preparación catártica y tienen mayor riesgo de morbilidad y

mortalidad. Se requieren claramente mejores pruebas con mayor sensibilidad, especificidad, facilidad de uso y disminución de los costes antes de que la detección amplia y generalizada del cáncer colorrectal se convierta en rutinaria. La detección temprana del cáncer colorrectal se basa generalmente en la prueba de sangre oculta en las heces (FOBT) realizada anualmente en individuos asintomáticos. Las recomendaciones actuales adaptadas por varias organizaciones de salud, incluida la Sociedad Americana del Cáncer, piden que las pruebas de sangre oculta en las heces comiencen a los 50 años, que se repite cada año hasta que el paciente ya no se beneficie más de este sistema de detección. Una FOBT positiva conduce a un examen por colonoscopia del intestino, un procedimiento costoso e invasivo, con una tasa de complicaciones serias de una por cada 5.000 exámenes. Sólo el 12% de los pacientes con heces positivas para sangre son diagnosticadas con cáncer o pólipos grandes en el momento de la colonoscopia. Una cantidad de estudios muestran que la detección mediante FOBT no mejora la mortalidad relacionada con el cáncer o la supervivencia general. El cumplimiento de la prueba de sangre oculta ha sido pobre; menos del 20 por ciento de la población se ofrece o cumple con FOBT como se recomienda. Si FOBT se hace correctamente, el paciente recoge una muestra fecal de tres deposiciones consecutivas. Las muestras se obtienen mientras el paciente se adhiere a las directrices dietéticas y evita medicamentos que se sabe que inducen sangrado gastrointestinal oculto. En realidad, los médicos con frecuencia no instruyen a los pacientes adecuadamente, los pacientes con frecuencia no logran cumplir con el protocolo, y algunos pacientes encuentran la tarea de recoger las muestras fecales difícil o desagradable, por lo tanto, el cumplimiento con la prueba anual de sangre oculta es pobre. Si la sensibilidad y especificidad de la prueba pueden ser mejorados respecto a los métodos actuales, se podría reducir la frecuencia de las pruebas, se eliminaría la recolección de muestras consecutivas, se eliminarían las modificaciones del programa de la dieta y la medicación, y mejoraría el cumplimiento del paciente. Para agravar el problema de la conformidad, la sensibilidad y la especificidad de FOBT para detectar el cáncer de colon es pobre. La pobre especificidad de la prueba conduce a una colonoscopia innecesaria, añadiendo costos considerables para la detección del cáncer de colon.

Se ha calculado que la especificidad de la FOBT es en el mejor de los casos del 96%, con una sensibilidad del 43% (adenomas) y del 50% (carcinoma colorrectal) . La sensibilidad se puede mejorar usando un inmunoensayo FOBT tal como aquel producido bajo el nombre comercial 'InSureMR', con una sensibilidad mejorada del 77% (adenomas) y 88, 9% (carcinoma colorrectal) .

Los marcadores moleculares de una enfermedad ofrecen varias ventajas sobre otros tipos de marcadores, siendo una de las ventaja que incluso muestras de tamaños muy pequeños y/o muestras cuya arquitectura del tejido no se ha mantenido pueden ser analizadas muy eficientemente. En la última década se ha demostrado que una cantidad de genes son expresados diferencialmente entre carcinomas normales y de colon. Sin embargo, ningún marcador individual o combinación de marcadores ha demostrado ser suficiente... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar cáncer de colon en un sujeto que comprende:

i) poner en contacto el ADN genómico aislado de plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre obtenida del sujeto con al menos un reactivo, o serie de reactivos que distingue entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos una región objetivo del ADN genómico, en donde dicha región objetivo comprende, o se hibrida en condiciones rigurosas con al menos 16 nucleótidos contiguos del gen o la secuencia de ALX4; y ii) detectar el cáncer de colon en un sujeto con base en el estado de metilación de al menos una secuencia del dinucleótido CpG objetivo, o un promedio, o un valor que refleja un estado de metilación promedio de una pluralidad de secuencias del dinucleótido CpG objetivo en dicha región objetivo.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la región objetivo comprende, o se hibrida bajo condiciones rigurosas con al menos 16 nucleótidos contiguos de la secuencia SEQ ID NO: 5, y los complementos de las mismas.

3. Un método para detectar cáncer de colon en un sujeto que comprende la determinación de los niveles de expresión de ALX 4 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, en donde dicha muestra es plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera, células sanguínea aisladas, células aisladas de la sangre obtenida de dicho sujeto.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho nivel de expresión se determina detectando la presencia, ausencia o el nivel del ARNm transcrito a partir de dicho gen o secuencia, o en donde dicho nivel de expresión se determina detectando la presencia, ausencia o el nivel de un polipéptido codificado por dicho gen o secuencia, o en donde dicha expresión se determina por la detección de la presencia o ausencia de metilación de CpG dentro de dicho gen o secuencia, en donde hipermetilación indica la presencia de un trastorno proliferativo de células de colon.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende:

a) extraer o bien aislar ADN genómico a partir de dicha muestra obtenida de dicho sujeto, b) tratar el ADN genómico de a) , o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina que no están metiladas en la posición 5 del mismo en uracilo o en otra base que es detectablemente diferente a la citosina en términos de propiedades de hibridación; c) poner en contacto el ADN genómico tratado, o el fragmento tratado del mismo, con una enzima de amplificación y al menos dos cebadores que comprenden, en cada caso una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos que sea complementaria a, o que hibride en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 65, 66, 67, y 68, y complementos de las mismas, en donde el ADN genómico tratado o el fragmento del mismo o bien se amplifica para producir al menos un amplificado, o no se amplifica; y d) determinar, con base en la presencia o ausencia de, o de una propiedad de dicho amplificado, el estado de metilación de al menos un dinucleótido CpG, o un promedio, o un valor que refleja un estado de metilación promedio de una pluralidad de dinucleótidos CpG en la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 5.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el tratamiento del ADN genómico, o el fragmento del mismo en b) , comprende el uso de un reactivo seleccionado del el grupo que consiste de bisulfito, sulfito de hidrógeno, disulfito, y combinaciones de los mismos.

7. El método de la reivindicación 5 o 6, que comprende además en la etapa d) el uso de al menos una molécula de ácido nucleico o molécula de ácido nucleico peptídico que comprende en cada caso una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o se hibrida bajo condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 65, 66, 67, y 68, y complementos de las mismas, en donde dicha molécula de ácido nucleico o molécula de ácido nucleico peptídico suprime la amplificación del ácido nucleico con el cual se hibrida.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde la determinación en d) comprende la hibridación de al menos una molécula de ácido nucleico o molécula de ácido nucleico peptídico en cada caso que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o se hibrida bajo condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 65, 66, 67, y 68, y complementos de las mismas.

9. El método de la reivindicación 8, en donde al menos una de tales moléculas de ácido nucleico que se hibridan o molécula de ácido nucleico peptídico está unida a una fase sólida, y/o en donde al menos una de tales moléculas de ácido nucleico que se hibridan se extiende por al menos una base de nucleótidos.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en donde la determinación en d) , comprende la secuenciación del amplificado.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en donde poner en contacto o la amplificación en c) , comprende el uso de cebadores específicos para metilación.

12. Un método para detectar cáncer de colon en un sujeto que comprende:

a) proporcionar, de un sujeto, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre obtenida del sujeto que tiene ADN genómico del sujeto; b) extraer, o bien aislar el ADN genómico; c) poner en contacto el ADN genómico de b) , o un fragmento del mismo, que comprende al menos 16 nucleótidos contiguos de una secuencia que consiste de la SEQ ID NO: 5, y las secuencias que se hibridan bajo condiciones rigurosas a la misma, con una o más enzimas de restricción sensibles a la metilación, en donde el ADN genómico es, con respecto a cada motivo de reconocimiento de la escisión de la misma, ya sea escindido de este modo para producir fragmentos de escisión, o no escindido de ese modo; y d) detectar el cáncer de colon en un sujeto con base en el estado de metilación de al menos un dinucleótido CpG de una secuencia que consiste de la SEQ ID NO: 5, o un promedio, o un valor que refleja un estado de metilación promedio de una pluralidad de dinucleótidos CpG de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 5.

13. El uso de un ácido nucleico, que puede obtenerse por amplificación de un ácido nucleico genómico aislado que tiene una secuencia de acuerdo a la SEQ ID NO: 5, en donde dicha secuencia de ADN genómico se amplifica después de un tratamiento con un reactivo seleccionado del grupo que consiste de bisulfito, sulfito de hidrógeno, disulfito, y combinaciones de los mismos con el fin de convertir al menos una base de citosina no metilada de la secuencia genómica de ADN en uracilo u otra base que sea detectablemente diferente a la citosina en términos de hibridación para la detección de cáncer de colon en un sujeto en el plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera o células sanguíneas aisladas del sujeto o células aisladas de la sangre obtenida del sujeto.

14. El uso de un kit para detectar de acuerdo con un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende:

a) un reactivo de bisulfito; y b) un conjunto de oligonucleótidos cebadores que contiene al menos dos oligonucleótidos cuyas secuencias en cada caso corresponden, son complementarias, o se hibridan bajo condiciones rigurosas o altamente rigurosas con un segmento de 16 bases de largo de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 65 y 66, SEQ ID NOS: 67 y 68, y complementos de las mismas.

15. El uso de la reivindicación 14, que comprende además reactivos estándar para realizar un ensayo de metilación seleccionado del grupo que consiste en SNuPE, MSP MethyLight, Heavy Methyl, COBRA, secuenciación de ácidos nucleicos, y combinaciones de los mismos.