Ácidos grasos de cadena ramificada y producción biológica de los mismos.

Un método para producir ácido graso anteiso, comprendiendo el método cultivar una célula que comprende al menos un polinucleótido expresado en exceso, en donde un polinucleótido expresado en exceso es un polinucleótido en donde un polinucleótido expresado en exceso es un polinucleótido natural para la célula, cuyo producto se genera en mayor cantidad del que se encuentra normalmente en la célula, o un polinucleótido exógeno, comprendiendo dicho polinucleótido exógeno o expresado en exceso una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que cataliza al menos una de las siguientes reacciones:

(aa) conversión de piruvato a citramalato;

(bb) conversión de citramalato a citraconato;

(cc) conversión de citraconato a ß-metil-D-malato;

(dd) conversión de ß-metil-D-malato a 2-oxobutanoato; o

(ee) conversión de treonina a 2-oxobutanoato

bajo condiciones que permitan la expresión del polinucleótido o polinucleótidos y la producción de ácido graso anteiso, en donde la célula produce más ácidos grasos anteiso que una célula por otra parte similar que no comprende el polinucleótido o polinucleótidos.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2010/061544.

Solicitante: THE PROCTER & GAMBLE COMPANY.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: ONE PROCTER & GAMBLE PLAZA CINCINNATI, OH 45202 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: SAUNDERS,CHARLES,WINSTON, Xu,Jun, GREEN,PHILLIP RICHARD, CODY,DAVID BLAIR, KHAMBATTA,ZUBIN SAROSH.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/70 (Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a E. coli)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/10 (Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/52 (Genes que codifican enzimas o proenzimas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/02 (Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos orgánicos que contienen... > C12P7/64 (Grasas; Aceites; Ceras de tipo éster; Acidos grasos superiores, es decir, con una cadena lineal de al menos siete átomos de carbono unida a un grupo carboxilo; Aceites o grasas oxidadas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/88 (Liasas (4.))

PDF original: ES-2525150_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Ácidos grasos de cadena ramificada y producción biológica de los mismos Campo de la invención

La invención se refiere a células y a métodos para producir ácidos grasos, y más especialmente se refiere a células y a métodos para producir ácidos grasos de cadena ramificada anteiso y/o iso.

Antecedentes de la invención

Los ácidos grasos de cadena ramificada anteiso e iso son ácidos carboxilicos con una ramificación metilo en el carbono n-2 y n-1, respectivamente. Análogamente a otros ácidos grasos, los ácidos grasos de cadena ramificada anteiso e iso son útiles en fabricación, tales como p. ej. de productos alimentarios, detergentes, pesticidas y productos de higiene personal tales como champús, jabones y cosméticos.

Los ácidos grasos de cadena ramificada anteiso e iso se pueden sintetizar químicamente o se pueden aislar a partir de determinados animales y bacterias. Aunque algunas bacterias, tales como Escherichia coli, no producen de manera natural ácidos grasos de cadena ramificada anteiso o iso, algunas bacterias, tales como los miembros del género Bacillus y Streptomyces, producen de manera natural ácidos grasos de cadena ramificada anteiso e iso. Por ejemplo, tanto Streptomyces avermitilis como Bacillus subtilis producen ácidos grasos anteiso con un total de 15 a 17 átomos de carbono, y ácidos grasos ramificados en iso con un total de 15, 16 y 17 átomos de carbono (Cropp y col., Can. J. Microbiology 46: 56-14 (2); De Mendoza y col., Biosynthesis and Function of Membrane Lipids, en Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonenshein and Losick, eds., American Society for Microbiology, (1993)). En FEMS MICROLIOLOGY LETTERS, Vol. 31, N.° 2, con fecha 26 de octubre de 219, páginas 188-192, se describe un método para producir ácidos grasos anteiso en E. coli usando FabH de Listeria. Sin embargo, estos organismos no producen ácidos grasos de cadena ramificada iso y/o anteiso en cantidades que sean comercialmente útiles. Otra limitación de estos organismos naturales es que, aparentemente no producen ácidos grasos de cadena ramificada anteiso y/o iso de cadena media, tales como los que tienen 11 o 13 átomos de carbono.

De esta forma, sigue existiendo necesidad de un producto producido de forma biosintética comercialmente útil de ácidos grasos de cadena ramificada anteiso y/o iso. Además, existe necesidad de un método de producción de dichos ácidos grasos de cadena ramificada anteiso y/o iso.

Sumario de la invención

Se proporcionan métodos para producir ácidos grasos de cadena ramificada anteiso y/o iso (que también se denominan en la presente memoria como ácidos grasos anteiso y/o iso). El polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que cataliza una reacción asociada con la producción de ácido graso de cadena ramificada en la célula.

En un aspecto, la invención proporciona un método para producir un ácido graso anteiso. El método comprende cultivar una célula que comprende al menos un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que cataliza al menos una de las siguientes reacciones: (aa) conversión de piruvato en citramalato; (bb) conversión de citramalato en citraconato; (cc) conversión de citraconato en (3-metil-D- malato; (dd) conversión de (3-metil-D-malato en 2-oxobutanoato; o (ee) conversión de treonina en 2-oxobutanoato, en condiciones que permitan la expresión del polinucleótido o polinucleótidos, y la producción del ácido graso anteiso. La célula produce más ácidos grasos anteiso de lo que haría una célula similar que no comprendiera el polinucleótido o polinucleótidos. En algunas realizaciones, la célula comprende al menos un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que cataliza al menos una de las siguientes reacciones: (ff) conversión de 2-oxobutanoato a 2-aceto-2-hidroxi-butirato, (gg) conversión de 2-aceto-2- hidroxi-butirato a 2,3-dihidroxi-3-metilvalerato, o (hh) conversión de 2,3-dihidroxi-3-metilvalerato a 2-ceto-3- metilvalerato. Opcionalmente, el método además comprende extraer el ácido graso anteiso del cultivo, o extraer del cultivo un producto derivado del ácido graso anteiso.

La invención también proporciona una célula que comprende un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una treonina desaminasa, un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una a-cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa, y un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una 3-cetoacil-ACP sintetasa, en donde los polinucleótidos se expresan en la célula. Adicionalmente, la invención también proporciona una célula que comprende un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una citramalato des sistetasa, un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una a-cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa, y un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una 3-cetoacil-ACP sintetasa, en donde los polinucleótidos se expresan en la célula. De manera opcional, la

célula comprende un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una acetohidroxiácido sintetasa y/o un polinucléotido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una tioesterasa. También se proporciona un método para producir ácido graso anteiso cultivando la célula.

Se ha descrito en la presente memoria una célula que tiene al menos un polinucleótido exógeno. De forma alternativa o adicional, la célula comprende un polinucleótido que se expresa en exceso. El polinucleótido tiene una secuencia de ácido nucleico que cataliza una de las siguientes reacciones: conversión de isoleucina en 2-ceto, 3-metilvalerato; conversión de 2-ceto, 3-metilvalerato en 2-metilbutiril-CoA; conversión de 2-metilbutiril-CoA en 2-metilbutiril-ACP; conversión de 2-metilbutiril-ACP en 4-metil 3-cetohexanoil-ACP; conversión de 2-metilbutiril-CoA en 4-metil 3- cetohexanoil-ACP; o conversión de acil-ACP en ácidos grasos anteiso. La célula que comprende el polinucleótido exógeno produce más ácidos grasos anteiso de lo que haría una célula similar que no comprendiera el polinucleótido exógeno.

También se ha descrito un método para aumentar los ácidos grasos anteiso en una célula bacteriana. El método incluye expresar en una célula bacteriana un polinucleótido que codifica un polipéptido que cataliza una de las siguientes reacciones: conversión de 2-ceto, 3-metilvalerato en 2-metilbutiril-CoA; conversión de 2-metilbutiril-CoA en 2-metilbutiril-ACP; conversión de 2-metilbutiril-ACP en 4-metil 3-cetohexanoil-ACP; conversión de 2-metilbutiril- CoA en 4-metil 3-cetohexanoil-ACP; o conversión de acil-ACP en ácidos grasos anteiso, y cultivar las células bacterianas en condiciones que permitan a la célula producir el polipéptido de forma que se produzcan ácidos grasos anteiso.

Se describe adicionalmente una célula de Escherichia coli que produce ácidos grasos anteiso.

También se ha descrito un método para aumentar los ácidos grasos anteiso en una célula. El método incluye expresar en una célula un polinucleótido que codifica una aminoácido de cadena ramificada aminotransferasa exógena, una a-cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa (BCDH) exógena, y una 3-cetoacil-ACP sintetasa... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para producir ácido graso anteiso, comprendiendo el método cultivar una célula que comprende al menos un polinucleótido expresado en exceso, en donde un polinucleótido expresado en exceso es un polinucleótido en donde un polinucleótido expresado en exceso es un polinucleótido natural para la célula, cuyo producto se genera en mayor cantidad del que se encuentra normalmente en la célula, o un polinucleótido exógeno, comprendiendo dicho polinucleótido exógeno o expresado en exceso una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que cataliza al menos una de las siguientes reacciones:

(aa) conversión de piruvato a citramalato;

(bb) conversión de citramalato a citraconato;

(cc) conversión de citraconato a (3-metil-D-malato;

(dd) conversión de p-metil-D-malato a 2-oxobutanoato; o

(ee) conversión de treonina a 2-oxobutanoato

bajo condiciones que permitan la expresión del polinucleótido o polinucleótidos y la producción de ácido graso anteiso, en donde la célula produce más ácidos grasos anteiso que una célula por otra parte similar que no comprende el polinucleótido o polinucleótidos.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además extraer del cultivo el ácido graso anteiso o un producto derivado de ácido graso anteiso.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la célula comprende además al menos un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que cataliza al menos una de las siguientes reacciones:

(ff) conversión de 2-oxobutanoato a 2-aceto-2-hidroxi-but¡rato,

(gg) conversión de 2-aceto-2-hldroxi-butirato a 2,3-d¡h¡droxl-3-met¡lvalerato, o

(hh) conversión de 2,3-dihidroxi-3-metllvalerato a 2-ceto-3-metilvalerato, y, opcionalmente, la célula se modifica para atenuar la actividad de aminoácido de cadena ramificada aminotransferasa.

4. El método de la reivindicación 3, en donde la célula comprende polinucleótidos exógenos o expresados en exceso que codifican polipéptidos que catalizan las reacciones (ee) y (ff).

5. El método de la reivindicación 4, en donde la célula comprende un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que codifica una treonina desaminasa y un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que codifica una acetohidroxiácido sintetasa.

6. El método de la reivindicación 5, en donde la treonina desaminasa es E. coli TdcB y/o la acetohidroxiácido sintetasa es E. coli llvlH, E. coli llvlH (G14D), E. coli llvGM, o B. subtilis llvBH.

7. El método de la reivindicación 3, en donde la célula además comprende un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un aminoácido de cadena ramificada aminotransferasa, un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una a-cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa, un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una acil transferasa, un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una 3-cetoacil-ACP sintetasa, un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una enoil-ACP reductasa, un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una tioesterasa, o una de sus combinaciones.

8. El método de la reivindicación 7, en donde la célula comprende un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una a-cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa, un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una 3-cetoacil-ACP sintetasa, y opcionalmente, un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una tioesterasa.

9. Una célula que comprende:

(i) un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una treonina desaminasa o un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que codifica una citramalato sintetasa;

(¡i) un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una a-cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa, y

(iii) un polinucleótido exógeno o expresado en exceso que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una 3-cetoacil-ACP sintetasa,

en donde un polinucleótido expresado en exceso es un polinucleótido natural para la célula, cuyo producto se genera en mayor cantidad del que se encuentra normalmente en la célula, y

en donde los polinucleótidos se expresan y la célula produce más ácido graso anteiso que una célula por otra parte similar que no comprende el polinucleótido o polinucleótidos.

1. La célula de la reivindicación 9, en donde (i) la treonina desaminasa es E. coli TdcB o la citramalato sintetasa es CimA derivada de M. jannaschii, (¡i) la a-cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa es B. subtilis Bkd y (iii) la 3-cetoacil-ACP sintetasa es B. subtilis FabH.