Método y reactivo para determinar ácido mevalónico, 3-hidroximetilglutaril-coenzima A y coenzima A.

Un método para medir una concentración de un analito en una solución de ensayo,

en donde el analito es ácido mevalónico y/o 3-hidroximetilglutaril-coenzima A, que comprende las siguientes etapas (p) y (q):

(p) una etapa que permite que una enzima que cataliza una reacción representada por la ecuación química 1:

Ácido mevalónico + Coenzima A + 2 Aceptor de hidrógeno X → 3-Hidroximetilglutaril-coenzima A + 2 Aceptor de hidrógeno reducido X (Ecuación química 1) y una enzima que cataliza una reacción representada por la ecuación química 2:

Ácido mevalónico + Coenzima A + 2 Donador de hidrógeno oxidado Y → 3-Hidroximetilglutaril-coenzima A + 2 Donador de hidrógeno Y (Ecuación química 2) actúen en la solución de ensayo que contiene ácido mevalónico y/o 3-hidroximetilglutaril-coenzima A en presencia de un aceptor de hidrógeno X, un donador de hidrógeno Y y coenzima A; y

(q) una etapa de medición de una cantidad de: un aceptor de hidrógeno reducido X que se produce; o un donador de hidrógeno oxidado Y que se produce; o un aceptor de hidrógeno X que disminuye; o un donador de hidrógeno Y que disminuye,

en donde el donador de hidrógeno Y y el aceptor de hidrógeno reducido X no son el mismo.

Método y reactivo para determinar ácido mevalónico, 3-hidroximetilglutaril-coenzima A y coenzima A Campo técnico

La presente invención se refiere a un método y un reactivo para medir el ácido mevalónico, 3-hidroximetilglutaril- coenzima A y coenzima A.

Antecedentes de la técnica

Hacer el seguimiento de la cantidad de colesterol sintetizado en el cuerpo es muy importante para el diagnóstico de diferentes afecciones patológicas y similares. En el cuerpo, el colesterol es sintetizado por la ruta del mevalonato a partir de acetll-coenzlma A a través de la 3-hldroximetilglutaril-coenzima A (en lo sucesivo denominada también HMG-CoA), ácido mevalónico (en lo sucesivo denominado también MVA), y similares. Puesto que la conversión de la HMG-CoA en MVA catalizada por la hldroxlmetllglutaril-coenzima A reductasa es una etapa determinante de la velocidad en esta ruta del mevalonato, la cantidad de colesterol sintetizada en el cuerpo se puede calcular midiendo la cantidad de ácido mevalónico (bibliografía de no patente 1). Hasta ahora, el MVA en una muestra biológica se ha medido por un ensayo radioenzlmátlco (bibliografía de no patente 2), cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) (bibliografía de no patente 3 y 11), cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (LC-MS) (bibliografía de no patente 4), un ensayo usando anticuerpos (bibliografía de no patente 5) y similares. Sin embargo, como se muestra en los documentos mencionados antes, las concentraciones de MVA en el suero son muy bajas (de 63 a 2 nM [bibliografía de no patente 1], de 2 a 75 nM [bibliografía de no patente 2], 18 nM [bibliografía de no patente 3], de 7,7 a 86,2 nM [bibliografía de no patente 6], y hasta ahora no se ha descrito una medición de concentraciones de MVA en el suero por un ensayo colorimétrico usando una enzima. Como en el caso del MVA, se piensa que la HMG-CoA también es Importante como un indicador del metabolismo del colesterol en el cuerpo, pero hasta ahora no se ha descrito la medición de las concentraciones de HMG-CoA por un ensayo colorimétrico usando una enzima.

El ácido mevalónico tiene dos isómeros ópticos, que se denominan ácido D-mevalónico y ácido L-mevalónico por la notación D/L y ácido R-mevalónico y ácido S-mevalónico por la notación R/S. Aunque el ácido D-mevalónico (se puede expresar como ácido R-mevalónico) es metabolizado y puede servir como un sustrato de la mevalonato quinasa y la hidroximetilglutaril-coenzima A reductasa en el cuerpo, el ácido L-mevalónico (se puede expresar como ácido S-mevalónico) no es metabolizado en el cuerpo.

En la presente memoria descriptiva, una expresión "ácido D,L-mevalónico" o "D,L-MVA" representa ácido mevalónico racémico que es una mezcla de la forma D y la forma L. Cuando en la presente memoria descriptiva se usa simplemente la expresión "ácido mevalónico" o "MVA", la expresión representa ácido D-mevalónico o ácido R-

mevalónico.

Igualmente, la 3-hidroximetilglutaril-coenzima A también tiene dos isómeros ópticos, que se denominan D-3- hidroximetilglutaril-coenzima A y L-3-hidroximetilglutaril-coenzima A por la notación D/L y como R-3- hidroximetilglutaril-coenzima A y S-3-hidroximetilglutaril-coenzima A por la notación R/S. Mientras que la D-3- hidroximetilglutaril-coenzima A (se puede expresar como S-3-hidroximetilglutaril-coenzima A) es metabolizada (puede servir como sustrato de la hidroximetilglutaril-coenzima A reductasa) en el cuerpo, la L-3-hidroximetilglutaril- coenzima A (se puede expresar como R-3-hidroximetilglutaril-coenzima A) no es metabolizada en el cuerpo.

En la presente memoria descriptiva, la expresión "D,L-3-hidroximetilglutaril-coenzima A" o "D,L-HMG-CoA", representa la 3-hidroximetilglutaril-coenzima A racémica que es una mezcla de la forma D y la forma L. Cuando se usa simplemente la expresión "3-hidroximetilglutaril-coenzima A" o "HMG-CoA", el término representa la D-3- hidroximetilglutaril-coenzima A o S-3-hidroximetilglutaril-coenzima A.

Además, se cree que la coenzima A (denominada en lo sucesivo también como CoA) es importante como un indicador o similar, del metabolismo de lípidos en el cuerpo. Sin embargo, hasta ahora no se ha descrito la medición conveniente de concentraciones de CoA por un ensayo colorimétrico usando una enzima.

Se ha descrito un método cíclico enzimático como método para medir la concentración de un analito con alta sensibilidad por un ensayo colorimétrico usando una enzima. El método cíclico enzimático es un método de amplificación de una señal derivada de un analito A por una reacción cíclica enzimática que implica un aceptor de hidrógeno X y un donador de hidrógeno Y (aquí, el donador de hidrógeno Y y el aceptor de hidrógeno reducido X no son la misma sustancia). El esquema del método enzimático cíclico se representa por una combinación de la siguiente ecuación química 3:

Esquema 1

A + Aceptor de hidrógeno X > A (óxido) + Aceptor de hidrógeno reducido X (Ecuación química 3) y la ecuación química 4:

A + Donador de hidrógeno oxidado Y A (óxido) + Donador de hidrógeno Y (Ecuación química 4)

Aquí, A es un analito, el donador de hidrógeno Y y el aceptor de hidrógeno reducido X no son la misma sustancia, y se añade una enzima que cataliza las ecuaciones químicas 3 y 4, un aceptor de hidrógeno X y un donador de hidrógeno Y, a una solución de ensayo que contiene el analito A para llevar a cabo las reacciones enzlmátlcas mencionadas antes. El analito A se somete a un ciclo entre A y A (óxido) durante la reacción, y se producen el aceptor de hidrógeno reducido X y el donador de hidrógeno oxidado Y dependiendo del número de ciclos. Por lo tanto se amplifica una señal procedente del analito A, y se puede medir el analito A con alta sensibilidad por la medición colorlmétrlca de la cantidad de aceptor de hidrógeno reducido X, el donador de hidrógeno oxidado Y, la disminución de aceptor de hidrógeno X o la disminución de donador de hidrógeno Y.

En general, cuando se aumenta la cantidad de una enzima añadida a una mezcla de reacción en una reacción cíclica enzimática, el número de reacciones cíclicas enzimáticas por unidad de tiempo aumenta, mejorando así la sensibilidad. Sin embargo, es imposible añadir una enzima a una mezcla de reacción en una determinada cantidad o más, o mejorar la medición de la sensibilidad debido a: 1) la constante de la velocidad de reacción (kcat) de una enzima implicada en una reacción; 2) la cantidad de una enzima que se puede disolver en una mezcla de reacción; 3) la pureza de la enzima usada; y similares. Por lo tanto, la reacción cíclica enzimática tiene un límite inferior de la concentración medlble de un analito. Cuando el aceptor de hidrógeno X es dlnucleótido de adenina y tionicotinamida oxidado (en lo sucesivo denominado también T-NAD) o fosfato de dlnucleótido de adenina y tionicotinamida (en lo sucesivo denominado también T-NADP), y el donador de hidrógeno Y es dinucleótido de adenina y nicotinamida reducido (en lo sucesivo denominado también NADH) o fosfato de dlnucleótido de adenina y nicotinamida (en lo sucesivo denominado también NADPH) en el método cíclico enzlmátlco mencionado antes, el límite inferior de la concentración medlble de un analito normalmente es aproximadamente de 1 a 1 pM (bibliografía de patentesl y 2 y bibliografía de no patentes 7 y 8).

Los ejemplos del límite Inferior de la concentración medible en un ensayo muy sensible usando el método cíclico enzimático incluyen: ,2 pM cuando el analito A es ácido cólico, y la enzima que cataliza la reacción cíclica enzimática es la 3a-esterolde deshldrogenasa (bibliografía de patente 3); ,2 pM cuando el analito A es glucosa-6- fosfato, y la enzima que cataliza la reacción cíclica enzimática es glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (bibliografía de patente 4); y ,1 pM cuando el analito A es un colesterol y la enzima que cataliza la reacción cíclica enzimática es la colesterol deshldrogenasa (bibliografía de no patente 9). Además, cuando el aceptor de hidrógeno X es oxígeno y el donador de hidrógeno Y es NADH o NADPH reducido, se podrían medir concentraciones hasta el límite inferior de ,3 pM usando glicerol-3-fosfato como un analito, que se obtiene por degradación del ácido lisofosfatídico con ácido lisofosfatídico lipasa y usando glicerol-3-fosfato oxidasa y glicerol-3-fosfato deshidrogenasa como enzimas que catalizan una reacción cíclica y detectan peróxido de hidrógeno, que es un aceptor de hidrógeno reducido X, con peroxidasa, 4-aminoantipirina y TOOS (bibliografía de no patente 1).

En particular, las reacciones cíclicas enzimáticas en las que el aceptor de hidrógeno X es T-NAD o T-NADP y el... [Seguir leyendo]

1.- Un método para medir una concentración de un analito en una solución de ensayo, en donde el analito es ácido mevalónico y/o 3-hidroximetilglutaril-coenzima A, que comprende las siguientes etapas (p) y (q):

(p) una etapa que permite que una enzima que cataliza una reacción representada por la ecuación química 1:

Ácido mevalónico + Coenzima A + 2 Aceptar de hidrógeno X 3-Hidroximetilglutaril-coenzima A + 2 Aceptar de hidrógeno reducido X (Ecuación química 1) y una enzima que cataliza una reacción representada por la ecuación química 2:

Ácido mevalónico + Coenzima A + 2 Donador de hidrógeno oxidado Y 3-Hidroximetilglutaril-coenzima A + 2 Donador de hidrógeno Y (Ecuación química 2)

actúen en la solución de ensayo que contiene ácido mevalónico y/o 3-hidroximetilglutaril-coenzima A en presencia de un aceptor de hidrógeno X, un donador de hidrógeno Y y coenzima A; y

(q) una etapa de medición de una cantidad de: un aceptor de hidrógeno reducido X que se produce; o un donador de

hidrógeno oxidado Y que se produce; o un aceptor de hidrógeno X que disminuye; o un donador de hidrógeno Y que disminuye,

en donde el donador de hidrógeno Y y el aceptor de hidrógeno reducido X no son el mismo.

2.- Un método para medir una concentración de un analito en una solución de ensayo, en donde el analito es 15 coenzima A, que comprende las siguientes etapas (p) y (q):

(p) una etapa que permite que una enzima que cataliza una reacción representada por la ecuación química 1:

Ácido mevalónico + Coenzima A + 2 Aceptor de hidrógeno X 3-Hidroximetilglutaril-coenzima A + 2 Aceptor de hidrógeno reducido X (Ecuación química 1) y una enzima que cataliza una reacción representada por la ecuación química 2:

Ácido mevalónico + Coenzima A + 2 Donador de hidrógeno oxidado Y > 3-Hidroximetilglutaril-coenzima A + 2 Donador de hidrógeno Y (Ecuación química 2)

actúen en la solución de ensayo que contiene la coenzima A en presencia de un aceptor de hidrógeno X, un donador de hidrógeno Y y ácido mevalónico; y

(q) una etapa de medición de la cantidad de: un aceptor de hidrógeno reducido X que se produce; o un donador de hidrógeno oxidado Y que se produce; o un aceptor de hidrógeno X que disminuye; o un donador de hidrógeno Y que disminuye,

en donde el donador de hidrógeno Y y el aceptor de hidrógeno reducido X no son el mismo.

3.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde:

el aceptor de hidrógeno X se selecciona de un grupo de dinucleótidos de nicotinamida y adenina oxidados; y/o el donador de hidrógeno Y se selecciona de un grupo de dinucleótidos de nicotinamida y adenina reducidos.

4.- El método según la reivindicación 3, en donde:

los dinucleótidos de nicotinamida y adenina oxidados se seleccionan del grupo que consiste en un dinucleótido de adenina y nicotinamida oxidado, un fosfato de dinucleótido de adenina y nicotinamida oxidado, un dinucleótido de adenina y tionicotinamida oxidado, un fosfato de dinucleótido de adenina y tionicotinamida oxidado, un dinucleótido de nicotinamida y adenina acetilado oxidado y un fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina acetilado oxidado, y combinaciones de los mismos; y/o

los dinucleótidos de nicotinamida y adenina reducidos se seleccionan del grupo que consiste en un dinucleótido de adenina y nicotinamida reducido, un fosfato de dinucleótido de adenina y nicotinamida reducido, un dinucleótido de adenina y tionicotinamida reducido, un fosfato de dinucleótido de adenina y tionicotinamida reducido, un dinucleótido de nicotinamida y adenina acetilado reducido y un fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina acetilado reducido, y combinaciones de los mismos.

5.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde:

la enzima que cataliza la reacción representada por la ecuación química 1 es la hidroximetilglutaril-coenzima A reductasa; y/o

la enzima que cataliza la reacción representada por la ecuación química 2 es la hidroximetilglutaril-coenzima A reductasa.

6.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la enzima que cataliza la o las

reacciones representadas por la ecuación química 1 y/o ecuación química 2 es:

(i) un proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 3; o

(ii) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye la eliminación, adición y/o sustitución de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 3 y que tiene una actividad de catalizar la o las reacciones representadas por la ecuación química 1 y/o la ecuación química 2.

7.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 6, en donde la solución de ensayo contiene ácido mevalónico y 3-hidroximetilglutaril-coenzima A, el analito es 3-hidroximetilglutaril-coenzima A, y el método comprende además la siguiente etapa (o) antes de la etapa (p):

() una etapa de eliminar el ácido mevalónico de la solución de ensayo.

8.- El método según la reivindicación 7, en donde la etapa (o) se lleva a cabo por una reacción de mevalonato quinasa.

9.- El método según la reivindicación 7, en donde:

la etapa (o) se lleva a cabo por una reacción de mevalonato quinasa, y después la etapa (p) se lleva a cabo sin realizar un procedimiento de aislamiento; y

la mevalonato quinasa es:

(1) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID

NO: 5; o

(ii) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye la eliminación, adición y/o sustitución de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 y que tiene una actividad de catalizar una reacción representada por la ecuación química 21:

Ácido mevalónico + ATP Fosfato de ácido mevalónico + ADP (Ecuación química 21)

1.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 6, en donde la solución de ensayo contiene ácido mevalónico y 3-h¡drox¡met¡lglutar¡l-coenz¡ma A, el analito es ácido mevalónico, y el método comprende además la siguiente etapa (o) antes de la etapa (p):

(o) una etapa de separación de la 3-h¡droximet¡lglutar¡l-coenzima A de la solución de ensayo.

11- El método según la reivindicación 1, en donde la etapa (o) se lleva a cabo mediante una reacción enzimática.

12.- Un reactivo para medir el ácido mevalónico y/o la 3-hidroximetilglutaril-coenzima A, que comprende: una hidroximetilglutanl-coenzima A reductasa; una coenzima A;

un dinucleótido de adenina y tionicotinamida oxidado y/o un fosfato de dinucleótido de adenina y tionicotinamida oxidado; y

un dinucleótido de adenina y mcotinamida reducido y/o un fosfato de dinucleótido de adenina y tionicotinamida reducido.

13.- Un reactivo para medir la coenzima A, que comprende: una hidroximetilglutanl-coenzima A reductasa; un ácido mevalónico;

un dinucleótido de adenina y tionicotinamida oxidado y/o un fosfato de dinucleótido de adenina y tionicotinamida oxidado; y

un dinucleótido de adenina y mcotinamida reducido y/o un fosfato de dinucleótido de adenina y tionicotinamida reducido.

14.- Un reactivo para medir la 3-hidroximetilglutaril-coenzima A, que comprende: una hidroximetilglutanl-coenzima A reductasa;

una mevalonato quinasa; una coenzima A; un donador de fosfato;

un dinucleótido de adenina y tionicotinamida oxidado y/o un fosfato de dinucleótido de adenina y tionicotinamida 5 oxidado; y

un dinucleótido de adenina y nicotinamida reducido y/o un fosfato dinucleótido de adenina y tionicotinamida reducido.

15.- Un reactivo para medir el ácido mevalónico que comprende: una hidroximetilglutaril-coenzima A reductasa;

una hidroximetilglutaril-coenzima A liasa;

una coenzima A;

un dinucleótido de adenina y tionicotinamida oxidado y/o un fosfato de dinucleótido de adenina y tionicotinamida oxidado; y

un dinucleótido de adenina y nicotinamida reducido y/o un fosfato de dinucleótido de adenina y tionicotinamida 15 reducido.