Procedimiento de purificación de G-CSF.

Procedimiento de purificación de factor recombinante estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF),

que comprende al menos dos cromatografías de intercambio catiónico las cuales se realizan respectivamente antes y después de la cromatografía de interacción hidrofóbica.

Procedimiento de purificación de G-CSF.

Se describe un procedimiento para la obtención de factor recombinante estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) y comprende al menos una cromatografía de intercambio catiónico y al menos una cromatografía de interacción hidrófoba, siendo estas dos clases de cromatografía efectuadas de manera inmediatamente consecutiva y en cualquier orden de sucesión. La invención se refiere a un procedimiento que es para la purificación de G-CSF a partir de una mezcla de G-CSF y otras proteínas y comprende dos pasos de cromatografía de intercambio catiónico que son respectivamente efectuados antes y después de una cromatografía de interacción hidrofóbica. El G-CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos) es un factor de crecimiento que se da de manera natural y pertenece a la familia de las citoquinas en el sentido más amplio y aquí al grupo de los factores estimuladores de colonias. El G-CSF desempeña un papel decisivo en la hematopoyesis y promueve la proliferación y diferenciación de células precursoras hematopoyéticas y la activación de neutrófilos. Debido a estas propiedades, el G-CSF ha encontrado aplicación en distintos ámbitos médicos, como p. ej. la reconstitución de las poblaciones de células sanguíneas normales tras quimioterapia o irradiación, o para la estimulación de la respuesta inmune frente a patógenos infecciosos. Así, el G-CSF se aplica en la clínica principalmente en la lucha antitumoral y en particular para el tratamiento la neutropenia sobrevenida como consecuencia de una quimioterapia, y encuentra además utilización también en los trasplantes de médula ósea y en el tratamiento de enfermedades infecciosas.

En su forma que se da de manera natural, el G-CSF humano es una glicoproteína con un peso molecular de aproximadamente 20.000 daltons y presenta cinco residuos de cisteína. Cuatro de estos residuos forman dos puentes disulfuro intramoleculares que son de gran importancia para la actividad de la proteína. Puesto que el G-CSF puede ser obtenido tan sólo en pequeñas cantidades a partir de sus fuentes naturales, para la fabricación de fármacos se usan principalmente formas recombinantes de G-CSF, que por ejemplo pueden ser obtenidas mediante expresión en células de mamífero tales como las células CHO (células de ovario de hámster chino) o en células procarióticas tales como E. coli. Las proteínas recombinantes que son expresadas en células de mamífero se diferencian del G-CSF que se da de manera natural en un distinto patrón de glicosilación, mientras que en las proteínas que son expresadas en E. coli las cuales como consecuencia de la expresión bacteriana pueden presentar un adicional residuo de metionina N-terminal, está completamente ausente la glicosilación.

La fabricación recombinante de G-CSF fue descrita en la literatura de patentes por primera vez en 1987, en la WO 87/01132 Al. El primer preparado de G-CSF comercial a base de G-CSF recombinante fue homologado en Alemania en 1991 y es fabricado y comercializado con el nombre comercial de Neupogen® por la firma Amgen.

La producción de G-CSF en células procarióticas ciertamente se prefiere a la producción en células de mamífero, ya que pueden utilizarse sistemas de expresión y condiciones de cultivo más sencillos, si bien en la fabricación de proteínas recombinantes en células procarióticas un problema que surge frecuentemente es el de la formación de agregados intracelulares poco solubles de formas desnaturalizadas de la proteína expresada, que son los llamados cuerpos de inclusión, que presentan en parte una estructura secundaria y pueden encontrarse en el citoplasma de las células bacterianas.

La formación de estos cuerpos de inclusión conduce a que las proteínas, tras el aislamiento de los cuerpos de inclusión mediante centrifugación a velocidad moderada, deban ser solubilizadas y renaturalizadas mediante medios adecuados, para obtener su configuración activa. En esto, la reacción de concurrencia entre una conversión de la proteína desnaturalizada en el correcto intermediario de plegamiento y una agregación de varias moléculas de proteína constituye un importante factor que limita la producción de proteína renaturalizada.

En el estado de la técnica diversos documentos de patente se ocupan del aspecto de la solubilización y renaturalización de proteínas obtenidas en cuerpos de inclusión. En la EP-A-0 719 860, por ejemplo, se describen el aislamiento y la purificación de G-CSF, incluyendo la solubilización y el replegamiento. Técnicas generales para la solubilización y re-naturalización de proteínas desnaturalizadas han sido descritas en los documentos EPA-0 512 097, EP-A-0 364 926, EP-A-0 219 874 y WO 01/87925 y pueden además sacarse de la literatura científica y de las obras estándar de la química de las proteínas.

La proteína replegada es a continuación purificada mediante métodos cromatográficos, es decir que es separada de otras proteínas y demás impurezas que están contenidas tras la solubilización y renaturalización.

También se ocupa de la purificación cromatográfica el documento WO 87/01132 A1 ya anteriormente mencionado, en el cual fue descrita por primera vez la fabricación de G-CSF en células huésped E. coli. Dentro del marco de la purificación del G-CSF recombinante se efectúa en el documento WO 87/01132 A1 en el Ejemplo 7 una cromatografía de intercambio catiónico utilizando una columna de CM-celulosa (CM-celulosa = carboximetilcelulosa) .

En la EP 0 719 860 A1 el G-CSF es purificado a continuación de la solubilización y oxidación mediante resina Dowex para la eliminación del medio solubilizante, seguidas por una cromatografía de intercambio aniónico y una cromatografía de intercambio catiónico. También en la EP 0 719 860 A1 se utiliza CM-Sepharose (= carboximetil

Sepharose) (N.d.T. o también podría decirse en español CM-Sefarosa, o carboximetil-Sefarosa) para la cromatografía de intercambio catiónico.

En la WO 03/051922 A1 se describe un procedimiento de purificación de G-CSF en el que se efectúa una cromatografía de afinidad metálica, o dicho más exactamente, una cromatografía por metal inmovilizado (immobilized metal affinity chromatography, IMAC) . A continuación de la cromatografía de afinidad metálica puede tener lugar en la WO 03/051922 una cromatografía de intercambio catiónico y/o una filtración en gel.

En la WO 01/04154 A1 está descrito un procedimiento de purificación de G-CSF en el que se efectúan primeramente una cromatografía de interacción hidrofóbica y a continuación de la misma una cromatografía en hidroxiapatita. A continuación de la cromatografía en hidroxiapatita se efectúa una cromatografía de intercambio catiónico.

Es una finalidad de la presente invención la de indicar un procedimiento de purificación de G-CSF humano recombinante biológicamente activo con el que el G-CSF pueda ser obtenido con una pureza y un rendimiento satisfactorios. El procedimiento debe ser además de ejecución lo más sencilla y supervisable posible. Es deseable un procedimiento de purificación en el que baste con tan pocos pasos cromatográficos como sea posible, para mantener a bajo nivel la complejidad técnica y los costes y para evitar grandes pérdidas de proteína.

Estas y otras finalidades son alcanzadas mediante el procedimiento que se indica en la reivindicación 1. En las reivindicaciones dependientes se describen formas de realización preferidas.

Se descubrió que con la purificación cromatográfica de G-CSF re-naturalizado mediante una cromatografía de intercambio catiónico y una cromatografía de interacción hidrofóbica puede alcanzarse una aceptable pureza del G-CSF recombinante biológicamente activo con un rendimiento satisfactorio. La pureza puede ser adicionalmente incrementada mediante un segundo paso de cromatografía de intercambio catiónico.

La invención se refiere con ello a un procedimiento de purificación de G-CSF humano biológicamente activo fabricado recombinantemente, en el que se efectúan al menos una cromatografía de intercambio catiónico y al menos una cromatografía de interacción hidrofóbica, teniendo lugar estos pasos cromatográficos en cualquier orden de sucesión y ciertamente sin que entre estos pasos tenga lugar otro paso cromatográfico u otro paso de purificación. Así pues, la cromatografía de intercambio catiónico y la cromatografía de interacción hidrofóbica se siguen inmediatamente una a otra.

Por "G-CSF humano biológicamente activo" se entiende según la invención que el G-CSF purificado mediante el procedimiento según la invención está en condiciones de promover la diferenciación y proliferación de células... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de purificación de factor recombinante estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) , que comprende al menos dos cromatografías de intercambio catiónico las cuales se realizan respectivamente antes y después de la cromatografía de interacción hidrofóbica.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el cual el G-CSF a purificar es un Met-G-CSF humano producido en células de E. coli.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el cual como material de partida para la purificación cromatográfica se emplea G-CSF re-naturalizado.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, donde la preparación de plegamiento se clarifica antes del primer paso 10 de cromatografía.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, que comprende además una filtración de flujo tangencial a continuación de la última cromatografía de intercambio catiónico.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, donde no se efectúa cromatografía de intercambio aniónico alguna.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, donde no se efectúa una cromatografía de filtración en gel.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, donde no se efectúa HPLC alguna.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, donde no se efectúa una cromatografía de afinidad alguna.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, donde no se efectúa cromatografía en hidroxiapatita alguna.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes donde se usa una matriz de sulfopropilo para la cromatografía de intercambio catiónico.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, donde en calidad de ligandos hidrófobos se usan 25 grupos fenilo para la cromatografía de interacción hidrofóbica.

13. Utilización del G-CSF purificado según el procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes para la producción de una preparación farmacéutica que contiene el G-CSF y excipientes aceptables en farmacia, tales como tampones, sales y estabilizantes.